绿竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对dNTPs、Mg^(2+)、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA设置7个不同浓度梯度进行研究,并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,dNTPs浓度为0.2 mol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA用量为50 ng,10×PCR buffer体积为2μL、剩余体积用灭菌dd H2O补全。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次;72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。本研究建立了绿竹ISSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为绿竹的指纹图谱、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定等研究提供了基础。