铁蓄积环境对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

Effect of excess iron culturing on the proliferation and osteogenic differentiation of rat bone mesen-chymal stem ceils

目的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在铁蓄积环境下培养，观察细胞增殖指标和成骨方向分化的影响。 方法无菌条件下取正常SD 4周龄雌性大鼠股骨髓腔细胞，经分离纯化后传代培养，并经流式细胞仪鉴定成功后，体外扩增后接种，由不同浓度枸橼酸铁铵（FAC）（50、100、200 μmol/L）及成骨诱导培养基共同培养，以不加FAC为空白对照组，在第4、7、10、14天收集细胞，采用实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR），分别检测成骨细胞分化关键基因：成骨相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）表达；在第14天茜素红染色并半定量检测钙结节形成情况；细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测不同浓度FAC对BMSCs增殖的影响。 结果随着铁剂浓度的增加，大鼠BMSCs的增殖能力逐渐降低；BMSCs经成骨诱导14 d后，在铁剂影响下，形成的钙结节较空白对照组明显减少，但铁剂干预各组间无明显差异，半定量结果亦显示相同结果（对照组：2.357±0.160、50 μmol/L组：0.308±0.029、100 μmol/L组：0.281±0.031、200 μmol/L组：0.224±0.017，P＝0.000）；不同浓度的铁剂对BMSCs成骨分化的各个阶段基因都有不同程度的影响。在成骨早期，Runx2的表达在对照组、100 μmol/L和200 μmol/L铁剂干预组有明显差异（对照组：1.000±0.229、100 μmol/L组：0.198±0.044、200 μmol/L组：0.149±0.009，P＝0.001），且与浓度存在一致相关性；在成骨中期，不同浓度铁剂对ALP的表达都具有明显抑制（对照组：0.980±0.063、50 μmol/L组：0.018±0.001、100 μmol/L组：0.014±0.002、200 μmol/L组：0.008±0.001，P＝0.001）；在成骨晚期阶段，不同浓度铁剂较对照组对OPN有明显抑制表达作用（对照组：0.999±0.001、50 μmol/L组：0.170±0.072、100 μmol/L组：0.142±0.008、200 μmol/L组：0.117±0.028，P＝0.003）。 结论铁蓄积培养环境可明显抑制BMSCs的增殖，同时抑制其向成骨细胞方向的分化，且有剂量依赖性。

ObjectiveTo investigate the proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） in the culture with excess iron. MethodsFour-week old female Sprague-Dawley （SD） rats were used for BMSCs isolation from bone marrow. BMSCs were identified by flow cytometry and exposed to ammonium iron citrate （FAC） （50, 100 and 200 μmol/L） under osteogenic medium for 1 to 2 weeks. The proliferation and differentiation of BMSCs were analyzed by cell counting kit-8 （CCK-8）, Alizarin Red S staining and real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-qPCR） tests. ResultsThe proliferation activity of BMSCs decreased with the increase of FAC concentration. The formation of calcium nodules decreased with the increase of FAC concentration （P=0.000）. The expression of osteogenic differentiation genes runt related transcription factor-2 （Runx2） decreased with the increase of FAC concentration （sham group： 1.000±0.229; 100 μmol/L FAC group： 0.198±0.044; 200 μmol/L FAC group： 0.149±0.009, P=0.001）. The mRNA expression of ALP decreased with the increase of FAC concentration （sham group： 0.980±0.063; 50 μmol/L FAC group： 0.018±0.001; 100 μmol/L FAC group： 0.014±0.002; 200 μmol/L FAC group： 0.008±0.001, P=0.001）. The mRNA expression of OPN decreased with the increase of FAC concentration （sham group： 0.999±0.001; 50 μmol/L FAC group： 0.170±0.072; 100 μmol/L FAC group： 0.142±0.008; 200 μmol/L FAC group： 0.117±0.028, P=0.003）. ConclusionThe ammonium iron citrate significantly inhibit the proliferation of rat BMSCs, and simultaneously suppress osteogenic differentiation of rat BMSCs dose-dependently.