樱桃病毒PNRSV、CGRMV、PDV多重RT-PCR检测方法的建立与应用

Development and application of a multiplex RT-PCR assay for detecting PNRSV、CGRMV、PDV in cherry

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus,简称PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,简称PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,简称CGRMV)的方法。根据GenBank中PNRSV、PDV、CGRMV的保守基因序列设计特异性引物,并对多重RT-PCR的退火温度、循环数、灵敏度、特异性、dNTPs浓度等因素进行优化,建立能同时检测3种樱桃病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PNRSV(675 bp)、CGRMV(363 bp)、PDV(304 bp)特异片段,扩增产物大小与预期相符。测序结果表明,3种病毒的序列与相应参考序列相似性达90%以上。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度为58℃、35个循环条件下,效果均较为理想;dNTP的浓度对试验结果影响不大,最适的浓度为0.6 mmol/L;灵敏度分析结果显示,最低检测浓度为59.7 ng/μL。应用该方法对新疆石河子地区的樱桃样本进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的3种樱桃病毒。