氧化损伤对视网膜色素上皮细胞三联组氨酸核苷结合蛋白1(HINT1)表达的影响

The effect of oxidative stress on the expression of histidine triad nucleotide-binding protein 1 in retinal pigment epithelial cells

目的探讨过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化损伤对三联组氨酸核苷结合蛋白1(histidine triad nucleotide binding protein 1,HINT1)表达的影响。方法将人ARPE-19细胞系分别用0μmol·L^(-1)H_2O_2(对照组)、50μmol·L^(-1)H_2O_2、100μmol·L^(-1)H_2O_2、200μmol·L^(-1)H_2O_2、400μmol·L^(-1)H_2O_2、600μmol·L^(-1)H_2O_26个浓度梯度处理。采用Live/Dead荧光双染法和MTT法分别检测细胞活力和增殖能力;采用Western blot检测RPE细胞内BAX、BCL-2以及HINT1的表达水平。结果 H_2O_2处理6 h后,对照组及50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1)、400μmol·L^(-1)及600μmol·L^(-1)H_2O_2组RPE细胞死亡率分别为(0. 35±0. 11)%、(2. 03±0. 87)%、(3. 76±1. 41)%、(12. 17±1. 26)%、(17. 69±2. 24)%、(25. 22±0. 59)%,RPE细胞死亡率呈剂量依赖性升高(P <0. 05)。H_2O_2作用后对照组及50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1)、400μmol·L^(-1)、600μmol·L^(-1)H_2O_2组RPE细胞生存率分别为(40. 72±2. 71)%、(37. 75±0. 62)%、(35. 30±0. 68)%、(34. 10±0. 74)%、(33. 61±0. 71)%、(31. 05±1. 41)%,RPE细胞增殖明显减少(P <0. 05),具有剂量-效应关系。随着H_2O_2浓度的增加,BAX蛋白表达逐渐上升(P <0. 01),而抗凋亡BCL-2蛋白表达则逐渐下降(P <0. 01),BAX/BCL-2比值相比对照组分别升高1. 85倍(50μmol·L^(-1)H_2O_2组)、2. 35倍(100μmol·L^(-1)H_2O_2组)、2. 86倍(200μmol·L^(-1)H_2O_2组)、3. 97倍(400μmol·L^(-1)H_2O_2组)、8. 50倍(600μmol·L^(-1)H_2O_2组); HINT1在H_2O_2处理的RPE细胞中以剂量依赖性方式逐渐下降(P <0. 01),分别下降0. 78倍(50μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 59倍(100μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 45倍(200μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 42倍(400μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 38倍(600μmol·L^(-1)H_2O_2组)。结论 H_2O_2氧化损伤诱导RPE细胞活力显著减弱,细胞凋亡相关蛋白BAX表达升高;同时,细胞中HINT1表达下调,表明HINT1可能通过影响细胞凋亡参与年龄相关性黄斑变性的发生,为其药物作用的潜在靶点。

Objective To investigate the effects of hydrogen peroxide( H2O2) on the expression of histidine triad nucleotide-binding protein 1( HINT1) in oxidative damaged retinal pigment epithelial( RPE) cells in vitro.Methods ARPE-19 cell line was cultured conventionally and treated with six different concentrations of H2O2 including 0 μmol ·L-1 H2O2( control group),50 μmol·L-1 H2O2,100 μmol·L-1 H2O2,200 μmol·L-1 H2O2,400 μmol ·L-1 H2O2,600 μmol ·L-1 H2O2 of treatment groups.Live/Dead fluorescent staining and MTT were utilized to evaluate cell viability and proliferative capacity,respectively.The expression of HINT1,BAX and BCL-2 in RPE cell were examined by western blot.Results The death rates of RPE cells treated with 0 μmol·L-1,50 μmol·L-1,100 μmol·L-1,200 μmol·L-1,400 μmol·L-1 and 600 μmol·L-1 of H2O2 for 6 h were( 0.35 ± 0.11) %,( 2.03 ± 0.87) %,( 3.76 ±1.41) %,( 12.17 ± 1.26) %,( 17.69 ± 2.24) %,( 25.22 ± 0.59) %,respectively,which significantly increased in a dose-dependent manner( P< 0.05).The proliferation rates of RPE cell treated with 0 μmol·L-1,50μmol·L-1,100 μmol·L-1,200 μmol·L-1,400 μmol·L-1 and 600μmol·L-1 of H2O2 were( 40.72 ± 2.71) %,( 37.75 ± 0.62) %,( 35.30 ± 0.68) %,( 34.10 ± 0.74) %,( 33.61 ± 0.71) %,( 31.05 ± 1.41) %,respectively presenting with reduced proliferation ability in a dosedependent manner( P < 0.05).With the increase of H2O2 concentration,BAX protein level gradually increased( P < 0.01),while anti-apoptotic protein BCL-2 gradually decreased( P < 0.01); The relative ratio of BAX/BCL-2 enhanced 1.85-fold( 50 μmol·L-1 H2O2),2.35-fold( 100 μmol·L-1 H2O2),2.86-fold( 200 μmol ·L-1 H2O2),3.97-fold( 400μmol·L-1 H2O2),8.50-fold( 600 μmol·L-1 H2O2),respectively compared with control group; The level of HINT1 significantly decreased in H2O2 treated RPE cells in a dose dependent manner( P < 0.01),with decreased 0.78-fold( 50 μmol ·L-1 H2O2),0.59-fold( 100 μmol ·L-1 H2O2),0.45-fold( 200 μmol·L-1 H2O2),0.42-fold( 400 μmol·L-1 H2O2),0.38-fold( 600 μmol ·L-1 H2O2),respectively compared with control group.Conclusion Oxidative injured RPE cells induced by different concentrations of H2O2 show decreased cell viabilities and increased level of apoptosis-related proteins.Meanwhile,the expression of HINT1 in RPE cells is down-regulated after treatment of H2O2,indicating HINT1 may play an important role in the pathogenesis of age-related macular degeneration( AMD) by regulating apoptosis.This research provides potential target for AMD therapy and drug development.