H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因核酸标准物质的制备及分析

Preparation and analysis of HA gene and NA gene nucleic acid reference materials of H5N8 Avian influenza virus

为了提高H5N8亚型禽流感病毒核酸检测结果的准确性,试验按照国家标准GB/T 19438.1-2004和GB/T 19438.2-2004选出禽流感病毒H5N8亚型毒株,根据HA和NA基因全长序列分别设计特异性引物进行扩增;利用基因克隆和体外转录技术制备出H5N8亚型禽流感病毒检测用核酸标准物质,并测定其浓度和纯度;采用实时荧光定量RT-PCR方法对体外转录产物HA-cRNA、NA-cRNA进行验证并绘制标准曲线;检测HA-cRNA、NA-cRNA的均匀性和稳定性,并通过协作标定方式对其含量及不确定度进行分析。结果表明:H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因片段大小为1704 bp和1413 bp,与预期大小一致。H5N8亚型禽流感病毒核酸标准物质HA基因的OD260/OD280值为1.93,浓度为11.32 ng/μL;NA基因的OD260/OD280值为2.06,浓度为14.24 ng/μL。体外转录产物HA-cRNA、NA-cRNA均有典型的扩增曲线,HA基因标准曲线回归方程为y=-3.5932x+25.867,R2=0.9971;NA基因标准曲线回归方程为y=-4.1537x+35.578,R2=0.9956。核酸标准物质的组间和组内精密度差异不显著(P>0.05),均匀性好。在不同温度保存时间内的核酸标准物质含量稳定,无明显变化;HA和NA基因核酸标准物质的最终定值结果为(4.13±0.18)×10^9copies/μL和(1.77±0.15)×10^10 copies/μL。说明试验制备的HA和NA基因核酸标准物质可作为H5N8亚型禽流感病毒核酸检测的标准质控品。