一氧化氮供体JS-K通过蛋白磷酸酶2A调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

Nitric oxide donor JS-K regulates phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway through protein phosphatase 2A to induce apoptosis in human hepatoma HepG2 cells

目的研究一氧化氮(NO)供体JS-K经蛋白磷酸酶2A(PP2A)调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的机制。方法设立细胞对照组(二甲亚砜<0.01%)、JS-K 2.5,5.0和10.0μmol·L^(-1)组、LY294002(PI3K抑制剂)10μmol·L^(-1)组、冈田酸(OA)(PP2A抑制剂)1 nmol·L^(-1)组、2-(4-羧苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷-1-氧-3-氧化钾(羧基-PTIO)50μmol·L^(-1)组、JS-K10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组,处理HepG2细胞24 h,DAPI染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western印迹法检测PP2A蛋白磷酸化水平及PI3K、Akt和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白磷酸化水平。结果DAPI染色结果显示,与细胞对照组相比,JS-K 2.5~10.0μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO50μmol·L^(-1)组具有细胞染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征的细胞数增加。与JS-K 10.0μmol·L^(-1)组相比,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组凋亡特征的细胞数增加,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组凋亡特征的细胞数减少。流式结果显示,与细胞对照组相比,JS-K 2.5~10.0μmol·L^(-1)、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。与JS-K10.0μmol·L^(-1)组相比,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),JS-K10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组细胞凋亡率显著下降(P<0.01)。Western印迹法结果显示,与细胞对照组相比,OA 1 nmol·L^(-1)组PP2A蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05),JS-K 2.5,5.0和10.0μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组PP2A蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05,P<0.01);PI3K,Akt和mTOR蛋白磷酸化水平均显著降低(P<0.05,P<0.01)。与JS-K 10.0μmol·L^(-1)组相比,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组PP2A蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.01);JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO50μmol·L^(-1)组细胞PI3K,Akt和mTOR蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论 NO供体JS-K通过在HepG2细胞内释放NO,降低PP2A磷酸化水平而活化PP2A,进一步降低PI3K,Akt和mTOR蛋白磷酸化水平,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路而诱导肝癌细胞凋亡。

OBJECTIVE To investigate the mechanism by which nitric oxide(NO)donor JS-K regulates phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B(PI3 K/Akt)signaling pathway iva protein phosphatase 2 A(PP2 A)to induce apoptosis in human hepatoma HepG2 cells.METHODS HepG2 cells were divided into cell control group(only an equal amount of dimethyl sulfoxide added at the final concentration<0.01%),JS-K 2.5,5.0 and 10.0μmol·L^(-1)group,LY294002(a PI3 K inhibitor)10μmol·L^(-1)group,okadaic acid(OA,a PP2 A inhibitor)1 nmol·L^(-1)group,carboxy-PTIO(a NO scavenger)50μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)combined with LY29400210μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)combined with OA 1 nmol·L^(-1)group,and JS-K 10.0μmol·L^(-1)combined with carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group.HepG2 cells were treated for 24 h.DAPI staining was used to observe changes in cell morphology.Flow cytometry was used for cell apoptosis.Western blotting was used to detect the phosphorylation levels of PP2 A,PI3 K,Akt,and mTOR.RESULTS The results of DAPI staining indicated that the apoptotic cells with obvious morphology including chromatin condensation and nuclear fragmentation were increased in JS-K 2.5,5.0 and 10.0μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group,and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group compared with cell control group.Compared with JS-K 10.0μmol·L^(-1),the apoptotic cells with obvious morphology were significantly increased in JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group while the apoptotic cells of JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO50μmol·L^(-1)group were decreased.Meanwhile,the results of flow cytometry also indicated that JS-K could significantly increase the apoptosis rate of JS-K 2.5,5.0 and 10.0μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group,and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group(P<0.01)compared with cell control group.Compared with JS-K 10.0μmol·L^(-1),the apoptotic rate of JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group was increased(P<0.01)while that of JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group was significantly decreased(P<0.01).Compared with the cell control group,the phosphorylation level of PP2 A was significantly increased in OA 1 nmol·L^(-1)group,but reduced in JS-K 2.5,5.0 and 10.0μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group,and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group using Western blotting(P<0.05,P<0.01).The phosphorylation levels of PI3 K,Akt and mTOR were significantly decreased in JS-K 2.5,5.0 and 10.0μmol·L^(-1)group,LY29400210μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group,and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO50μmol·L^(-1)group compared with cell control group(P<0.05,P<0.01).Compared with JS-K 10.0μmol·L^(-1)group,the phosphorylation level of PP2 A was obviously increased in JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group.Compared with JS-K 10.0μmol·L^(-1)group,the phosphorylation levels of PI3 K,Akt and m TOR were significantly reduced in JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY29400210μmol·L^(-1)group(P<0.05),while those of PI3 K,Akt and m TOR were significantly increased in JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)group and JS-K 10.0μmol·L^(-1)+carboxy-PTIO 50μmol·L^(-1)group(P<0.05,P<0.01).CONCLUSION JS-K could release NO to activate PP2 A by reducing the phosphorylation level of PP2 A,which further decreases the phosphorylation level of PI3 K,Akt and mTOR proteins,resulting in the inhibition of PI3 K/Akt/mTOR signaling pathway and inducing hepatoma cell apoptosis.