乙脑病毒RT-LAMP快速检测新方法的建立

为了实现一步快速检测乙脑病毒,试验采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术,利用具有高反转录酶活性的Bst 3.0 DNA聚合酶,根据乙脑病毒P3株NS1序列设计一组LAMP引物,以乙脑病毒NS1重组质粒为模板,针对影响LAMP反应结果的4个重要因素:反应温度、甜菜碱浓度、Mg^(2+)浓度、酶浓度进行单因素试验并优化反应体系。结果表明,当扩增温度为67℃,甜菜碱浓度为0.8mol•L^(-1),Mg^(2+)浓度为4mmol•L^(-1),酶浓度为0.32U·μL^(-1)时体系反应效率最佳。为进一步验证RT-LAMP检测方法,以乙脑病毒P3株为模板,进行扩增反应,结果显示成功。在结果判定方面,采用成本较低的钙黄绿素-MnCI2显色方法,并通过使用有色背景板,增强阳性与阴性结果间的差异,辅助判断。试验说明基于Bst 3.0 DNA聚合酶对乙脑病毒的一步检测是成功的,为研制一款灵敏度高、特异性强、检测成本低、可在猪场和基层实验室简单操作的JEV快速检测试剂盒做出探索,也为今后研发针对RNA病毒的高效检测方法提供参考。