一氧化氮供体JS-K联合阿司匹林促进人肝细胞癌细胞凋亡

Synergistic effect of nitric oxide donor JS-K and aspirin on apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells

目的研究一氧化氮供体(JS-K)与阿司匹林联合用药协同诱导人肝细胞癌(肝癌)HepG2和SMMC7721细胞凋亡的作用。方法人肝癌HepG2和SMMC7721细胞分别设立细胞对照组(只加等量二甲亚砜,终浓度<0.01%)、JS-K 5μmol·L^(-1)组、阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组、JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10,20 mmol·L^(-1)组。MTT法检测细胞增殖抑制率并计算联合用药指数(CI);倒置显微镜下观察细胞形态;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率。2种细胞分为6组:细胞对照、JS-K 5μmol·L^(-1)、阿司匹林20 mmo·L^(-1)、Z-VAD-FMK 50μmol·L^(-1)、JS-K+阿司匹林和JS-K+阿司匹林+Z-VAD-FMK组,给药后处理24 h。DAPI染色观察细胞核形态变化;Western印迹法检测活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表达。结果与JS-K 5μmol·L^(-1)组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组HepG2和SMMC7721细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05,P<0.01),且具有一定的协同作用(CI<1)。JS-K 5μmol·L^(-1)组、阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组、JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组细胞扁圆,生长迟缓,形态不规则,脱落并悬浮于培养液中。与JS-K 5μmol·L^(-1)组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10,20 mmol·L^(-1)组细胞凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.01)。DAPI染色结果显示,与JS-K 5μmol·L^(-1)单药组或阿司匹林20 mmol·L^(-1)单药组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林20 mmol·L^(-1)组细胞核染色质高度凝聚、边缘化,核碎裂等凋亡样特征更加明显,活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。与JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林20 mmol·L^(-1)组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林20 mmol·L^(-1)+Z-VAD-FMK 50μmol·L^(-1)组细胞核染色质高度凝聚、边缘化,核碎裂等凋亡特征减少,活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论JS-K与阿司匹林联用具有协同抑制HepG2和SMMC7721细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,其作用机制与激活胱天蛋白酶诱导的凋亡级联反应有关.

OBJECTIVE To study the synergistic apoptosis induction of nitric oxide(NO)donor(JS-K)combined with aspirin in human hepatocellular carcinoma HepG2 and SMMC7721 cells.METHODS HepG2 and SMMC7721 cells were divided into the cell control group(only an equal amount of dimethyl sulfoxide added,final concentration<0.01%),JS-K 5μmol·L^(-1) group,aspirin 5,10 and 20 mmol·L^(-1) groups,JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 5,10 and 20 mmol·L^(-1) groups.The cell inhibitory rate was determined by the MTT method,then the combination index(CI)was calculated according to MTT assay.The cell morphology was observed under an inverted microscope.The apoptosis rate was determined by AnnexinⅤ-FITC/PI double staining.HepG2 and SMMC7721 cells were divided into six groups:cell control,JS-K 5μmol·L^(-1),aspirin 20 mmol·L^(-1),Z-VAD-FMK 50μmol·L^(-1),JS-K+aspirin,and JS-K+aspirin+Z-VAD-FMK.The cells were treated for 24 h.Nuclear morphological changes were observed by DAPI staining.Western blotting was used to detect the expression levels of cleaved-caspase 9,cleaved-cas⁃pase 3,and cleaved poly ADP-ribose polymerase(PARP)proteins.RESULTS Compared with the JS-K 5μmol·L^(-1) group,HepG2 and SMMC7721 cells in JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 5,10,20 mmol·L^(-1) groups were significantly inhibited(P<0.05,P<0.01).The combination of JS-K(5μmol·L^(-1))with different concentra⁃tions of aspirin(5,10 and 20 mmol·L^(-1))had a good synergistic effect(CI<1).Most of the cells exhibited slow growth,irregular shape,fall-off and were suspended in the culture medium in the JS-K 5μmol·L^(-1) group,aspirin 5,10,20 mmol·L^(-1) groups,and JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 5,10,20 mmol·L^(-1) groups.Compared with the JS-K 5μmol·L^(-1) group,the apoptotic rate was significantly increased(P<0.05,P<0.01)in JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 5,10,20 mmol·L^(-1) groups.Furthermore,HepG2 and SMMC7721 cells in the JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 20 mmol·L^(-1) group with nuclear chromatin were more highly condensed and margin⁃alized,and the expressions of cleaved-caspase 9,cleaved-caspase 3,and cleaved-PARP were more significantly increased than those of the JS-K 5μmol·L^(-1) or aspirin 20 mmol·L^(-1) group(P<0.05,P<0.01).Compared with the JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 20 mmol·L^(-1) group,the apoptotic features of cells,such as nuclear fragmentation,were not obvious and the expression levels of cleaved-caspase 9,cleaved-caspase 3,and cleaved-PARP were significantly decreased in JS-K 5μmol·L^(-1)+aspirin 20 mmol·L^(-1) and Z-VAD-FMK 50μmol·L^(-1) groups(P<0.05,P<0.01).CONCLUSION The combination of JS-K and aspirin can synergistically inhibit proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells and SMMC7721,which may be related to the activation of caspase cascade.