桔梗中PgMCT和PgCMK的克隆及原核表达分析

目的从桔梗中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)和4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤藓糖醇激酶(CMK)基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学及原核表达分析。方法根据桔梗转录组数据,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到PgMCT和PgCMK序列,利用生物信息学软件预测PgMCT和PgCMK蛋白的特征;利用ClustalW和MEGA 6.06软件构建PgMCT和PgCMK的系统进化树;构建原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。结果PgMCT和PgCMK基因ORF全长为954、1227 bp,分别编码317、408个氨基酸,均为不稳定蛋白。PgMCT和PgCMK蛋白的二级结构中,均为无规卷曲所占比例最高。结构功能域分析PgMCT和PgCMK分别属于糖基转移酶GT-A超家族和IspE超家族,推测这2个蛋白均为非跨膜蛋白。预测PgMCT和PgCMK蛋白均无跨膜结构,为非跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,PgMCT和PgCMK诱导表达蛋白分别为55、50 kDa,与预期蛋白分子量一致。结论本实验首次从桔梗中克隆出MCT和CMK(命名为PgMCT和PgCMK),为进一步探究桔梗三萜皂苷成分的生物合成奠定了物质基础。