NF-κB基因调控对肾组织TGF-β和CTGF影响的研究

目的:肾小球硬化是多种慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)进展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要病理基础,研究发现转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)等细胞因子表达失衡最终造成肾小球硬化。探讨核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)基因调控对肾组织TGF-β和CTGF的影响,采用NF-κB的特异性抑制剂,抑制TGF-β和CTGF的基因表达,为延缓肾小球硬化提供实验依据。方法:采用阿霉素肾病大鼠模型进行实验,分为三组:(1)对照组:静脉生理盐水替代阿霉素,每只约注射1 ml。(2)模型组:尾静脉注射阿霉素5 mg/kg,第7天重复尾静脉注射阿霉素3 mg/kg。(3)干预组:同模型组方法造模,第1次尾静脉注射阿霉素后,次日开始尾静脉注射给予吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)6 mg/kg体重,每日1次,至第6周实验结束。分别于第6周后每组各处死大鼠6只,用于实验。肾小球硬化组织切片HE染色,通过免疫组织化学法评估大鼠肾脏中TGF-β和CTGF的蛋白情况;逆转录-定量聚合酶链反应(RT-PCR)分析TGF-β和CTGF的mRNA的表达;Western-blot分析TGF-β和CTGF蛋白表达的情况。结果:(1)模型组1周时即出现大量蛋白尿,随着时间的进展,蛋白尿持续增加,在第2、4、6周各时间点24 h尿蛋白与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01),另外干预组在第1、2、4和6周与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。(2)药物治疗及干预6周后,模型组在血清学尿素氮、肌酐及胆固醇较对照组明显升高,血清白蛋白水平较对照组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。干预治疗后,干预组在血清学尿素氮、肌酐及胆固醇水平较模型组明显下降,血清白蛋白较模型组升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)肾小球硬化病理学观察,模型组:细胞外基质明显增加,毛细血管壁塌陷,出现局灶节段性肾小球硬化(FSGS),间质纤维化。干预组:大鼠系膜细胞轻度增生,细胞外基质明显减少,部分呈局灶节段性硬化。肾组织病理改变,干预组明显轻于模型组。(4)免疫组织化学显示:各组肾组织TGF-β和CTGF蛋白的分布,与对照组比较,模型组大鼠肾组织TGF-β和CTGF蛋白分布明显增加。干预组与模型组比较,TGF-β和CTGF蛋白分布明显下降,两组差异有统计学意义(P<0.05)。(5)RT-PCR检测结果显示,TGF-β和CTGF的mRNA相对表达量,对照组TGF-β和CTGF的mRNA有微量表达,模型组与对照组比较,TGF-β和CTGF的mRNA相对表达量均明显上调(P<0.05);干预组与模型组比较,TGF-β和CTGF的mRNA相对表达量均明显下调(P<0.05)。(6)Western-blot分析,模型组与干预组比较,模型组TGF-β和CTGF的蛋白表达均明显上调(P<0.01);干预组与模型组比较,干预组TGF-β和CTGF的蛋白表达均明显下调(P<0.01)。结论:NF-κB参与TGF-β和CTGF的基因调控,NF-κB特异抑制剂可以有效抑制TGF-β和CTGF的mRNA与蛋白的表达,通过阻断肾脏纤维化中的NF-κB活化来抑制TGF-β和CTGF的表达,从而改善肾小球硬化,NF-κB抑制剂有望成为治疗肾小球疾病的新靶点。