吴茱萸碱对视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响

Effect of evodiamine on cell proliferation,apoptosis and cycle in retinoblastoma

目的探讨吴茱萸碱对视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,分析整合素β2-反义RNA1(ITGB2-AS1)在视网膜母细胞瘤中的表达和作用。方法取对数生长期HXO-Rb44细胞铺在96孔板上,用终浓度为1μmol·L^(-1)、2μmol·L^(-1)、4μmol·L^(-1)吴茱萸碱处理细胞24 h,记为吴茱萸碱1μmol·L^(-1)组、吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组、吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组,同时将不经吴茱萸碱处理的细胞设为对照组;按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将si-NC、si-ITGB2-AS1转染细胞,记为si-NC组、si-ITGB2-AS1组;将pcDNA、pcDNA-ITGB2-AS1转染细胞,再用4μmol·L^(-1)吴茱萸碱处理,记为吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA组、吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA-ITGB2-AS1组。采用MTT法测定细胞存活率,平板克隆实验计数克隆形成数,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,qRT-PCR检测ITGB2-AS1表达。结果吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组、吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组细胞存活率和克隆形成数较对照组、吴茱萸碱1μmol·L^(-1)组减小,差异均有统计学意义(均为P<0.05);吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组细胞存活率和克隆形成数较吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组减小,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组、吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组G_(0)-G_(1)期细胞比例较对照组、吴茱萸碱1μmol·L^(-1)组下降,G_(2)-M期细胞比例较对照组、吴茱萸碱1μmol·L^(-1)组升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组G_(0)-G_(1)期细胞比例较吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组下降,G_(2)-M期细胞比例较吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组、吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组细胞凋亡率较对照组、吴茱萸碱1μmol·L^(-1)组升高,ITGB2-AS1表达量较对照组、吴茱萸碱1μmol·L^(-1)组降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);吴茱萸碱4μmol·L^(-1)组细胞凋亡率较吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组升高,ITGB2-AS1表达量较吴茱萸碱2μmol·L^(-1)组降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。si-ITGB2-AS1组ITGB2-AS1表达量、细胞存活率、克隆形成数和G_(0)-G_(1)期细胞比例均较si-NC组降低,G_(2)-M期细胞比例、细胞凋亡率均较si-NC组升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA-ITGB2-AS1组细胞ITGB2-AS1表达量、细胞存活率和克隆形成数均较吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA组升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA-ITGB2-AS1组G_(0)-G_(1)期细胞比例较吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA组高,G_(2)-M期细胞比例、细胞凋亡率较吴茱萸碱4μmol·L^(-1)+pcDNA组低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论吴茱萸碱通过抑制ITGB2-AS1表达降低视网膜母细胞瘤细胞增殖,阻滞G_(2)-M期细胞周期,并促进细胞凋亡。

Objective To investigate the effect of evodiamine on cell proliferation,apoptosis and cycle in retinoblastoma and analyze the expression and role of integrinβ2-antisense RNA1(ITGB2-AS1)in retinoblastoma.Methods HXO-Rb44 cells in logarithmic phase were placed on 96-well plates and then were treated with 1μmol·L^(-1),2μmol·L^(-1),and 4μmol·L^(-1) evodiamine respectively for 24 hours.These cells were classified into the 1μmol·L^(-1)evodiamine group,2μmol·L^(-1) evodiamine group,and 4μmol·L^(-1) evodiamine group,and cells without evodiamine treatment were set as the control group.Cells transfected with si-NC and si-ITGB2-AS1 according to the instructions of the Lipofectamine 2000 kit were divided into the si-NC group and the si-ITGB2-AS1 group,respectively.Cells transfected with pcDNA and pcDNA-ITGB2-AS1 were further treated with 4μmol·L^(-1)evodiamine and marked as the 4μmol·L^(-1)evodiamine+pcDNA group and the 4μmol·L^(-1)evodiamine+pcDNA-ITGB2-AS1 group,respectively.The cell viability was measured by MTT assay,the colony forming number was counted by plate cloning experiment,the cell cycle and death were detected by flow cytometry,and the expression of ITGB2-AS1 was determined by quantitative real-time polymerase chain reaction.Results The cell viability and colony forming number in the 2μmol·L^(-1)and 4μmol·L^(-1)evodiamine groups were lower than those in the control group and 1μmol·L^(-1)evodiamine group(all P<0.05).The cell viability and colony forming number in the 4μmol·L^(-1)evodiamine group were lower than those in the 2μmol·L^(-1)evodiamine group(both P<0.05).The proportion of cells in the G0-G1 phase in the 2μmol·L^(-1)and 4μmol·L^(-1)evodiamine groups decreased,while the proportion of cells in the G2-M phase increased,compared with the control group and 1μmol·L^(-1)evodiamine group(all P<0.05).The proportion of cells in the G0-G1 phase in the 4μmol·L^(-1)evodiamine group was lower than that in the 2μmol·L^(-1)evodiamine group,while the proportion of cells in the G2-M phase was higher than that in the 2μmol·L^(-1)evodiamine group(both P<0.05).The cell apoptosis in the 2μmol·L^(-1)and 4μmol·L^(-1)evodiamine groups rose,while the expression of ITGB2-AS1 declined,compared with the control group and 1μmol·L^(-1)evodiamine group(all P<0.05).The cell apoptosis in the 4μmol·L^(-1)evodiamine group increased,while the expression of ITGB2-AS1 decreased,compared with the 2μmol·L^(-1)evodiamine group(both P<0.05).Compared with the si-NC group,the expression of ITGB2-AS1,the cell viability,the colony forming number,and the proportion of cells in the G0-G1 phase in the si-ITGB2-AS1 group were reduced,while the proportion of cells in the G2-M phase and the cell apoptosis were elevated(all P<0.05).The expression of ITGB2-AS1,the cell viability,and the colony forming number in the 4μmol·L^(-1)evodiamine+pcDNA-ITGB2-AS1 group were higher than those in the 4μmol·L^(-1) evodiamine+pcDNA group(all P<0.05).Compared with the 4μmol·L^(-1) evodiamine+pcDNA group,the proportion of cells in the G0-G1 phase in the 4μmol·L^(-1) evodiamine+pcDNA-ITGB2-AS1 group was higher,while the proportion of cells in the G2-M phase and the cell apoptosis were lower(all P<0.05).Conclusion Evodiamine can inhibit the proliferation of retinoblastoma cells,hinder the cell cycle in the G2-M phase and promote the cell apoptosis by downregulating the expression of ITGB2-AS1.