RAPA作用下针刺激活Ⅲ型PI3K-Beclin1通路抗脑缺血再灌注后细胞自噬的研究

目的探讨霉帕霉素(RAPA)作用下针刺激活Ⅲ型PI3K-Beclin1通路抗脑缺血再灌注后细胞自噬的研究,为临床针刺治疗脑血管疾病提供一定的实验依据。方法SD健康55只大鼠,随机分为假手术组11只、造模组44只。造模组参考线栓法制备大鼠CIRI模型。造模成功后再随机分为模型组、针刺组、模型+RAPA组和针刺+RAPA组。大鼠生命体征稳定后,假手术组、模型组、模型+RAPA组只捆绑固定不针刺;针刺组和针刺+RAPA组捆绑固定并针刺“大椎”、“人中”、“百会”穴,针后行捻转手法1 min(频率90次/min),每15 min行捻转手法1 min,留针30 min,每12h针刺1次,共7次。干预前及72h后进行改良Garcia评分观察大鼠神经功能损伤程度,TTC染色法观察大鼠脑梗死面积比,Western Blot法检测Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3II/I、Lamp2、P62蛋白的表达水平,透射电镜观察自噬小体。结果(1)改良Garcia神经功能评分:干预前,与假手术组比较,各造模组改良Garcia评分显著降低(P<0.01)。干预后,与假手术组比较,各造模组改良Garcia评分明显降低(P<0.01);与模型组比较,针刺组、模型+RAPA组和针刺+RAPA组改良Garcia评分明显升高(P<0.01)。组内干预前后比较,针刺组、模型+RAPA组和针刺+RAPA组较干预前改良Garcia评分上升(P<0.01)。(2)脑梗死面积比:与假手术组比较,各造模组脑梗死面积比明显升高(P<0.01);与模型组比较,针刺组、模型+RAPA组和针刺+RAPA组大鼠脑梗死面积比明显降低(P<0.01);与针刺组、模型+RAPA组比较,针刺+RAPA组大鼠脑梗死面积比降低(P<0.01)。(3)Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3II/I、Lamp2、P62表达水平:与假手术组比较,模型组Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3II/I、Lamp2表达水平显著降低,P62表达水平显著增高(P<0.01);与模型组比较,针刺组、模型+RAPA组、针刺+RAPA组Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3II/I、Lamp2表达显著升高,P62表达水平降低(P<0.01);与模型+RAPA组比较,针刺+RAPA组LC3II/I表达水平升高,P62表达水平降低(P<0.01)。(4)大鼠海马神经元自噬超微结构:假手术组神经元细胞呈轻微水肿,胞膜、核膜清晰、完整,Ly、SL、ASS、AP个别存在。模型组神经元细胞水肿较严重,大多数线粒体局部基质溶解,嵴减少;SL少量存在,未见典型自噬结构。模型+RAPA组神经元细胞呈中度水肿,细胞膜完整,观察到Ly、ASS数量较多。针刺组、针刺+RAPA组神经元细胞整体结构尚可,未见明显损伤,胞膜、核膜清晰、完整,Ly、SL存在,可见ASS、AP。结论针刺激活Ⅲ型PI3K-Beclin1通路,增加自噬标志物LC3II/I、Lamp2的表达,降低溶酶体标志物P62的表达,以激活适度自噬减轻CIRI。