基于TGF-β1/SMAD3信号通路探讨“易层”贴敷对膝骨关节炎模型大鼠滑膜纤维化的干预机制

Study of“Yi Ceng”Application Treating Synovial Fibrosis of Knee Osteoarthritis Model Rats Based on TGF-β1/SMAD3 Signal Pathway

目的:观察“易层”贴敷对膝骨关节炎(KOA)模型大鼠滑膜纤维化的干预作用及其对转化生长因子β1(TGF-β1)/细胞信号转导分子3(SMAD3)信号通路的影响,探索其对KOA的治疗机制。方法:将27只大鼠随机分为空白组、模型组和易层组,每组9只,模型组和易层组大鼠双膝采用前交叉韧带横断术(ACLT)制作KOA模型。造模成功后第14天开始,易层组采用“易层”贴敷疗法,即先后予复方三黄油膏、三色散敷药敷膝关节,每日贴敷8 h,连续贴敷28 d;模型组造模成功后不做干预。于易层组干预完成后,同期处死各组大鼠,取膝关节滑膜组织,备测。取每组3只大鼠的膝关节滑膜组织,固定、包埋、切片,分别行苏木精-伊红(HE)染色和天狼星红染色观察纤维化情况。免疫组化法观察每组3只大鼠膝关节滑膜组织TGF-β1、SMAD3、磷酸化-SMAD3(p-SMAD3)等TGF-β1/SMAD3信号通路相关指标表达。蛋白免疫印迹(Western blot)法和实时荧光定量PCR(q PCR)法分别检测每组3只大鼠膝关节滑膜组织Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、肌动蛋白α(α-SMA)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP1)、TGF-β1、SMAD3、高迁移率族蛋白1(HMGB1)的相对蛋白和基因表达量。结果:HE染色和天狼星红染色后病理图片显示,与空白组比较,模型组大鼠膝关节滑膜组织纤维化程度和炎性细胞浸润程度明显加重,易层组较模型组滑膜组织纤维化程度、炎性细胞浸润程度减轻。免疫组化法结果显示,与空白组比较,模型组大鼠膝关节滑膜组织TGF-β1、SMAD3、p-SMAD3表达明显增多,阳性着色(褐色)密集;易层组大鼠膝关节滑膜组织上述指标表达明显降低,阳性着色稀疏。Western blot法和q PCR法检测结果显示,模型组大鼠膝关节滑膜组织中TGF-β1/SMAD3信号通路的关键指标HMGB1、TGF-β1、SMAD3蛋白和基因相对表达明显高于空白组(P<0.05),易层组上述指标的表达则显著低于模型组(P<0.05);模型组大鼠膝关节滑膜组织中促纤维化相关因子TIMP1、Collagen I、α-SMA蛋白和基因相对表达明显高于空白组(P<0.05),易层组上述指标表达显著低于模型组(P<0.05)。结论:“易层”贴敷可能通过抑制TGF-β1/SMAD3信号通路活化从而改善滑膜纤维化,延缓KOA进展。