四种致泻性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及在大熊猫上的应用

致泻性大肠杆菌可引起大熊猫血水样便、休克,严重者可危及生命。为准确鉴定4种致泻性大肠杆菌病原,本研究通过对引物浓度、退火温度、反应条件等进行优化,建立了能同时检测EPEC和EHEC的多重PCR方法以及ETEC和EAEC的多重PCR方法。结果得出:两种多重PCR方法特异性强,仅对特有的毒力基因进行扩增,对其他10种大熊猫源病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,细菌基因组DNA检测中EHEC和EPEC的检测下限为2.71×10^(4)拷贝/μL,EAEC的检测下限为3.23×10^(4)拷贝/μL,ETEC的检测下限为3.23×10^(3)拷贝/μL;菌液检测中EPEC和EHEC的检测下限为1.85×10^(4)CFU/mL,ETEC的检测下限为2.9×10^(3)CFU/mL,EAEC的检测下限为2.62×10^(4)CFU/mL;不同时间段重复8次,均扩增出对应的目的条带,证明重复性好。利用多重PCR和单一PCR方法分别检测110份样品,结果得出esc V基因阳性率为1.82%(2/110),其余均为阴性;多重PCR与单一PCR方法的阳性符合率为100%。