miR-199a-3p通过靶向VEGFA缓解H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤

目的观察miR-199a-3p、血管内皮生长因子(VEGF)A对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导泪腺上皮细胞氧化应激、凋亡的作用并探究二者之间的关系。方法通过H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤模型。将泪腺上皮细胞随机分为对照组(不做任何处理)、H_(2)O_(2)组(200μmol/L)H_(2)O_(2)+anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p组(转染anti-miR-199a-3p)、H_(2)O_(2)+pcDNA组(转染pcDNA)、H_(2)O_(2)+pcDNA-VEGFA组(转染pcDNA-VEGFA)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-con组(共转染anti-miR-199a-3p和si-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-VEGFA组(共转染anti-miR-199a-3p和si-VEGFA),除对照组及H_(2)O_(2)组外,剩余组转染泪腺上皮细胞,再用H_(2)O_(2)处理2 h。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-199a-3p、VEGFA表达;Western印迹法检测细胞VEGFA、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达;免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果在H_(2)O_(2)的诱导下,泪腺上皮细胞中miR-199a-3p表达显著升高,而VEGFA表达显著下降(均P<0.05)。敲除miR-199a-3p表达可以降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。Starbase预测miR-199a-3p与VEGFA的3′非翻译区(UTR)端存在6个连续的结合位点,且miR-199a-3p明显抑制野生型VEGFA的荧光活性,并负向调控VEGFA蛋白表达(均P<0.05)。过表达VEGFA蛋白可降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。同时敲低miR-199a-3p和VEGFA,H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达显著增加,GSH、Bcl-2表达显著降低,且凋亡水平显著增加(均P<0.05)结论miR-199a-3p促进H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞氧化应激和凋亡,其机制与靶向调控VEGFA有关。