基于UHPLC-MS/MS、分子对接及细胞实验探讨健脾益气方对肝癌PD-L1和PD-1表达的影响

目的采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)、分子对接和体外细胞实验探讨健脾益气方对肝癌细胞的影响。方法制备健脾益气方甲醇水溶液并采用UHPLC-MS/MS法分析鉴定中药活性成分。利用Schrodinger软件对鉴定出的所有活性成分及信号通路核心靶点白介素6(IL-6)、糖蛋白130(gp130)、酪氨酸激酶1(JAK1)、酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导蛋白及转录激活子3(STAT3)、程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)和程序性细胞死亡配体1(PD-L1)分别进行分子对接;并用Pymol软件将各靶标蛋白结合能最低的活性成分对接模式进行可视化。采用健脾益气方含药血清干预人肝癌细胞株HepG2进行体外实验验证,将HepG2细胞分为空白组,模型组,健脾益气方低、中、高剂量组(5.25、10.5、21 g/kg),STAT3抑制组(C188-9,4μmol/L)和gp130抑制组(SC144,10μmol/L)。除空白组外,模型组加入IL-6(50 ng/mL),各给药组加入IL-6和相应药物进行干预。采用CCK-8法、Transwell培养小室法、Annexin V+PI双染色法分别检测各组细胞存活率、侵袭数和凋亡率,ELISA法检测各组细胞培养液中IL-6水平,Western blot法检测各组细胞中gp130、磷酸化JAK1(p-JAK1)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、PD-1和PD-L1蛋白表达。结果UHPLC-MS/MS鉴定出健脾益气方113个活性成分。分子对接结果显示,健脾益气方中有多个活性成分与IL-6、gp130、JAK1、JAK2、STAT3、PD-1和PD-L1靶点蛋白均分别存在分子结合位点且有较低结合能,均小于-5.0 kcal/mol。体外细胞实验显示,与空白组比较,模型组细胞侵袭数升高(P<0.01),细胞凋亡率则降低(P<0.01);培养液中IL-6水平升高(P<0.01);gp130、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3、PD-1和PD-L1蛋白表达均升高(P<0.01)。与模型组比较,除低剂量健脾益气方含药血清对细胞侵袭数的抑制和对细胞凋亡率的影响无明显变化外(P>0.05),其它各药物干预组均可抑制模型细胞的增殖与侵袭能力,促进细胞凋亡(P<0.01);各药物干预组均可降低模型细胞培养液中IL-6水平(P<0.01);并降低细胞中gp130、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3、PD-1和PD-L1蛋白表达(P<0.01)。结论健脾益气方可通过多成分调控肝癌细胞IL-6/STAT3炎症信号通路及其介导的PD-L1和固有PD-1的表达,抑制肝癌细胞增殖侵袭,促进细胞凋亡。