锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因的克隆与功能研究

几丁质主要存在于真菌的胞壁、甲壳类动物的外壳和昆虫的体壁中,高等哺乳动物不含有几丁质,因此根据几丁质生物合成途径研发新型杀虫剂已经成为当今热点。本研究以锈赤扁谷盗Cryptolestes ferrugineus为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qPCR)和RNAi技术对几丁质生物合成途径中的关键酶-几丁质合成酶2(CHS2)基因的特性和功能进行了深入的研究,为以后利用几丁质合成酶来防治锈赤扁谷盗提供理论基础与科学依据。我们首先以获得的锈赤扁谷盗转录组数据为基础,对其中一个预测为编码几丁质合成酶2的基因进行了克隆,首次获得了锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因完整的开放阅读框,命名为CfCSH2(NCBI登录号:MH234580),其开放阅读框ORF包含4 428bp,编码1 475个氨基酸,其中的322(523—845)个氨基酸是几丁质合成酶的保守序列,含有几丁质合成酶特有的标签序列EDR和QRRRW。实时荧光定量PCR结果显示,CfCSH2在锈赤扁谷盗卵、幼虫、蛹和成虫不同发育阶段均有表达,但表达量差异显著(P<0.05)。幼虫阶段CfCSH2在1龄的相对表达量最多,随后逐渐减少,在蛹期表达量最低,卵期有少量表达,成虫期最多,说明该基因在锈赤扁谷盗进食期表达量较多,非进食期表达量较少。CfCSH2在锈赤扁谷盗不同组织的表达量有显著差异(P<0.05)。在成虫表皮中基本不表达,在头部、胸部、脂肪体中有少量的表达,腹部的表达量最高,其次是中肠,腹部的高表达量可能与其样晶体积较大,包含组织较多有关。RNAi干扰实验结果表明:无论使用注射还是饲喂的方法,CfCHS2基因沉默后幼虫均出现躯体蜷缩,腹部干瘪,无法正常爬行的现象。对RNAi处理后的锈赤扁谷盗的中肠进行了甲苯胺蓝染色和透射电镜的研究,结果发现经过沉默CfCHS2基因后的幼虫中肠围食膜缺失,肠道上皮细胞没有围食膜的保护,不能附着在中肠横肌,严重受损。这些结果说明CfCHS2在锈赤扁谷盗中肠围食膜的形成过程中发挥重要的作用。CfCHS2基因的沉默会使锈赤扁谷盗发育受阻,导致死亡。实验选用纳米壳聚糖作为传递载体,通过饲喂法使目的基因的表达量显著下降,锈赤扁谷盗死亡率显著升高,为以后基于RNAi技术防治锈赤扁谷盗提供了科学依据。