可溶性VEGF受体sflt-1载体的构建

目的本文以逆转录病毒作为载体将sflt-1基因结构中前3个免疫球蛋白区域的编码序列插入 ,构建成含有sflt-1的载体 ,为抑制肿瘤的血管新生提供基础。方法与结果1、sflt-1基因制备购买新鲜胎盘 ,用异硫氰酸胍提取总RNA。经RT -PCR制备sflt-1基因 ,引物设计如下 :P1 :5’ -GGAATTCCGCGCTCAC CATGGTCAGC -3’ ;P2 :5’ -TTGGATCCTACCGCTTGCCAGCTACG GTTT-3’。目的基因共1080bp,包含sflt-1前三个免疫球蛋白区域 ,两端分别加上EcoRI和BamHI位点。PCR反应设定 :94℃5min,使模板充分变性 ,94℃1min ,55℃1min ,72℃1min30s ,共30个循环 ,72℃10min。PCR产物有目的片断和600bp的杂带 ,经调整复性温度不能去除 ,将含目的片断的凝胶条带切下并提取DNA。2、sflt—1基因片断的克隆与测序用 pUC -T-vector将目标DNA接入质粒 ,DNA片断A -tailing:2μl10Xbuffer,1UTaq酶 ,0 .5μl10mMdNTP ,纯化的DNA片断 ,共组成201反应体系。72℃15min。纯化DNA连接反应 ,1μlpUC_mT ,1μl2Xbuffer,1150 %PEG8000 ,纯化的DNA产物70g,0 .5μlT4DNA连接酶 ,加适量水组成10μl反应体系 ,20℃温育8h ,22℃温育8h ,连接反应产物转化感受态细菌 ,置于含50g/m1青霉素的LB平板 ,37℃过夜 ,挑取克隆在LB中扩增 ,提取质粒后用EcoRI和BamHI酶 切 ,