胃肠道平滑肌细胞作为eNOS基因转移靶细胞的研究

Gastrointestinal smooth muscle cell as target for gene transfer of eNOS gene

目的:构建内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达载体,介导eNOS在胃肠道平滑肌细胞中稳定表达并评价表达产物eNOS的酶学活性.方法:构建牛eNOS的重组腺病毒表达载体Ad-eNOS,感染体外培养的猫下段食管及胃底部平滑肌细胞,采用Western blot、RT-PCR技术检测eNOS在平滑肌细胞中的表达,测定基因转移后NOS活性以及一氧化氮(NO)产量,并研究不同施加因素对NOS活性及NO合成的影响.结果:Ad-eNOS可高效感染体外培养的胃肠平滑肌细胞(MOI=50,感染效率=74%),Western blot、RT-PCR结果证实eNOS在平滑肌细胞中高效表达.Ad-eNOS感染细胞后基础NOS活性比感染前显著增高(93±13 vs 47±13 nkat/L,P＜0.05),培养液中累积的NO增加了3倍(45±13 vs16±7μmol/L,P＜0.05).分别加入L-精氨酸(10-4mol/L)、钙离子(10-4 mol/L)、EGTA(钙离子螯合剂,10-4 mol/L)及L-NAME(NOS抑制剂,10-3mol/L)后,NOS活性分别为94±8,173±25,29±6,58±11 nka/L,NO含量分别为48±14,106±18,6±2,17±11 μmol/L.结论:构建的重组腺病毒Ad-eNOS能够高效介导eNOS基因在消化道平滑肌细胞中表达,表达产物eNOS活性受钙离子浓度调节,其作用底物L-精氨酸并不是NO合成的限速步骤.