LV3-KiSS1-miRNA的构建及其在体内外沉默效应观察

目的构建靶向Ki SS1基因的miRNA慢病毒质粒(LV3-Ki SS1-miRNA),并观察其在人胚肾293T细胞及SD大鼠体内的沉默效应。方法利用四质粒系统合成LV3-Ki SS1-miRNA,分别用LV3-Ki SS1-miRNA(观察组)、LV3-N-miRNA(对照病毒组)、细胞培养液(空白对照组)与Ki SS1的真核表达载体pc DNA3.1(+)-Ki SS1共转染293T细胞,72 h后采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)阳性表达率,RT-PCR法检测细胞中的Ki SS1 mRNA。将90只21日龄SD大鼠随机分为3组各30只,分别侧脑室注射LV3-Ki SS1-miRNA(干扰病毒组)、LV3-N-miRNA(对照病毒组)和生理盐水(生理盐水组)40μL,采用RT-PCT法检测30、35、45日龄时大鼠下丘脑组织中的Ki SS1mRNA。结果空白对照组中无GFP表达,而观察组与对照病毒组的GFP表达率分别为89.4%、94.2%。观察组与对照病毒组、空白对照组比较Ki SS1 mRNA表达量减少(P均<0.01),沉默效率达到86%;对照病毒组与空白对照组比较,P>0.05。干扰病毒组大鼠各日龄时下丘脑组织中Ki SS1 mRNA表达水平明显低于生理盐水组和对照病毒组(P均<0.05)。结论成功构建LV3-Ki SS1-miRNA,并能高效、稳定地抑制293T细胞及SD大鼠下丘脑组织中Ki SS1 miRNA的表达。