黑曲霉糖化酶cis调控区上两个CCAAT框协同参与基因启动子的转录激活作用

已报道的EMSA和Footprinting试验表明黑曲霉Aspergillus niger T21糖化酶基因glaA启动子区-489～-414bp及-390～-345bp(分别简称为DC,PC)是与蛋白粗提液中同一蛋白因子结合,并均含有CCAAT五核苷酸的序列。对DC,PC在糖化酶表达调控中的作用进行了分析,用CGTAA取代CCAAT,获得突变体DCm,PCm,两者均丧失体外结合蛋白因子的能力。突变体的体内分析结果显示,DC和PC中任何一个发生突变或改变DC,PC在原启动子中的相对方向,则启动子的活性下降到基础表达水平,将多拷贝串联后的DC引入A.niger T21glaA启动子原位,则内源糖化酶的表达和由该启动子引导的外源uidA基因的表达均发生下降,但由构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA引导的uidA的表达不受影响,而且EMSA结果表明不等DC拷贝的A.niger转化子中DNA结合蛋白的含量没有明显变化,表明多拷贝DC的引入引起了调控蛋白的滴定效应,从A.niger T21cDNA中克隆到AngHapC基因,将AngHapC基因引入上述含多拷贝DC而糖化酶低表达的A.niger菌株,AngHapC基因的表达使糖化酶的表达量得到明显回升。上述结果表明,DC和PC中CCAAT五核苷酸序列为蛋白因子结合所必需,而且两者必须同时与调控蛋白结合才能发挥促进转录的作用,AngHapC为与DC区域结合的正调节蛋白。