海马神经元Toll样受体4的髓样细胞分化因子非依赖途径在神经炎症中的作用

目的探讨海马神经元Toll样受体4(TLR4)介导的髓样细胞分化因子88(My D88)非依赖途径在神经炎症中的作用。方法构建3对针对My D88基因的特异siRNA序列,经脂质体途径转染入体外培养的海马神经元,通过免疫荧光检测转染效率和RT-q PCR选择最佳siRNA序列,并优化转染条件,达到沉默My D88基因而保留My D88非依赖途径的目的;将体外培养海马神经元随机分成4组:空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)、LPS组和siRNA组。采用RT-q PCR分别测定TLR相关分子(TRAM)、TLR4相关的干扰素活化子(TRIF)mRNA的表达;Western印迹检测TRIF蛋白水平;ELISA技术测量培养上清中TRAM、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)和白细胞介素-1β(IL-1β)浓度。结果 siRNA转染成功,siRNA2的沉默效果最佳,效率达94.3%,且最适转染浓度和时长分别为30 nmol/L和48 h。空白对照组和阴性对照组可观察到TRAM、TRIF mRNA以及TRIF蛋白的表达,同时上清液中也可以检测到TRAM、IP-10和IL-1β;LPS刺激组,上述检测指标的表达量均明显增高;siRNA组,在阻断My D88基因的前提下加LPS刺激,与空白对照组和阴性对照组相比,上述检测指标的水平均显著增高,但在上清液中,IL-1β的浓度低于LPS组。结论 siRNA序列能够成功转染入体外培养的海马神经元,发挥很强的沉默效率,达到理想的阻断My D88依赖型途径的作用;海马神经元有TLR4的My D88非依赖途径的存在的证据,当激动该途径时,相应炎症因子的表达上调;TLR4激活所致的My D88非依赖途径活化可能是神经退行性疾病的发病机制之一。