不同温度对人类肽基脯氨酰顺反异构酶蛋白及突变体交联反应的影响

目的研究不同温度对人类肽基脯氨酰顺反异构酶(hPPI)体外交联反应的影响。方法以人总RNA为模板设计正反引物进行h PPI基因克隆,以获取的正常型表达载体为模板,利用PCR定点突变的方法将hPPI基因中两个半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸(Ser),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达正常型和突变型蛋白,在不同温度条件下进行蛋白交联反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定交联现象。结论与溶菌酶表现相似,正常型hPPI蛋白交联反应随温度升高而逐渐加快,在达到蛋白变性温度时交联反应最明显,出现大量二聚体和多聚体条带;将突变型hPPI蛋白置于与正常型hPPI蛋白完全相同的反应条件下,观察不到任何交联条带。结论热变性可显著改变蛋白高级结构,蛋白对热变性无明显特异性,在变性温度临界条件下表现出相同的聚合作用;二硫键可导致蛋白结构改变,从而影响交联结果。