GAD65基因特异siRNA的构建和功能检测

目的构建GAD65基因特异的siRNA并检测体外功能。方法应用RT-PCR方法克隆大鼠GAD65基因、测序、重组病毒包装检测体外功能。针对GAD65基因的编码区,设计3条siRNA片段及一条对照片段,将其分别亚克隆于siRNA的慢病毒表达载体并小量包装获得病毒颗粒(LV-GFP-siRNA-r GAD65);用siRNA病毒颗粒感染GAD65过表达的293细胞,检测GAD65表达情况,从中筛选出高效特异的siRNA。大量包装特异的siRNA病毒颗粒,在体外感染培养的大脑皮质细胞,在体内注射到SD大鼠的苍白球内侧部,检测r GAD65的表达水平,观察siRNA的功能。结果应用RT-PCR方法克隆r GAD65基因,其序列与Gen Bank中的基因序列几乎一致(99.72%),包装病毒后在293细胞中过表达。筛选出针对r GAD65的高效特异的siRNA,在GAD65基因的沉默效率可达到66%。在体外、体内分别应用Western印迹检测感染了LV-GFP-siRNA3-r GAD65的大脑皮质细胞和定点注射了LV-GFP-siRNA3-r GAD65的大鼠GPi。结论成功克隆r GAD65基因,设计、筛选出高效特异的siRNA,并证明这种siRNA在体内和体外均能有效地沉默r GAD65的表达。