实验大鼠Ｒｅｏ３病毒抗体试剂盒的研制与Ｒｅｏ３病毒血凝条件的探讨

应用ELISA试验方法研制了实验大鼠Reo3病毒抗体试剂盒,用IFA和HAl法验证了该试剂盒的特异性,其敏感性是HAI法检测抗体阳性率的两倍,重演性试验也比较理想。应用本试剂盒调查了开放大鼠及清洁大鼠抗体,前者阳性率为29%.后者为0。关于ReO3病毒血凝素的制备较适条件以及血球的选择也作了介绍。

笛榇笫螅遥澹铮巢《究固迨约梁械难兄朴耄遥澹铮巢《狙跫奶教?##2@吴惠英,朱家新,卫礼,贺争鸣,张然,刘佐民$中国药品生物制品检定所, 浙江省医科院实验动物中心##3应用ELISA试验方法研制了实验大鼠Reo3病毒抗体试剂盒,用IFA和HAl法验证了该试剂盒的特异性,其敏感性是HAI法检测抗体阳性率的两倍,重演性试验也比较理想。应用本试剂盒调查了开放大鼠及清洁大鼠抗体,前者阳性率为29%.后者为0。关于ReO3病毒血凝素的制备较适条件以及血球的选择也作了介绍。##4大鼠Reo3,病毒抗体检测,ELISA试剂盒,血凝素##5实验大鼠Reo3病毒抗体试剂盒的研制与Reo3病毒血凝条件的探讨吴惠英,朱家新,卫礼,贺争鸣,张然,刘佐民中国药品生物制品检定所[摘要]应用ELISA试验方法研制了实验大鼠Reo3病毒抗体试剂盒,用IFA和HAl法验证了该试剂盒的特异性,其敏感性是HAI法检测抗体阳性率的两倍,重演性试验也比较理想。应用本试剂盒调查了开放大鼠及清洁大鼠抗体,前者阳性率为29%.后者为0。关于ReO3病毒血凝素的制备较适条件以及血球的选择也作了介绍。关键词:大鼠Reo3,病毒抗体检测,ELISA试剂盒,血凝素Reo3病毒在啮齿类动物的感染相当普遍,Paker氏(1)报道该病毒在实验小鼠中8种病毒中占第二位,笔者对开放饲养小鼠中抗体的调查阳性率高达36%(2),实验大鼠罹患本病的屡见不鲜,国内未见有关报道。Wartlev氏(3)指出该病毒污染鼠群后会干扰肿瘤的移植,能起消瘤的作用,并常从移植性腹水瘤中分离到该病毒。由于在鼠群中常呈隐性感染,所以该病毒污染其它病毒的可能性较大。本实验研制该试剂盒为加强对实验大鼠Reo3病毒抗体的常规检测提供一些方便。材料和方法一、试剂盒中冻干材料:(1)正常BSC一1适当稀释,含蛋白0.37μg/ml。(2)Reo3特异性抗原,含蛋白2μg/ml。(3)兔抗大鼠IgG辣根酶结合物,工作浓度为1:8000。(4)Reo3大鼠阴性血清:来自清洁大鼠。(5)Reo3大鼠阳性血清:各地送检样品中选择。作者单位:北京天坛西门邮编:100050电话:7017755一413浙江省医科院实验动物中心二、Reo3毒种:Abney株,从ATCC引进。抗原的制备有两种:(1)包被用抗原:Reo3病毒感染BSC-1细胞,CPE达+++时收获,用聚乙二醇(PEG,分子量6000)处理。(2)免疫用抗原:Reo3感染BSC-1,冻融,超声波处理,上清液40000r/min离心处理。也可用感染了Reo3病毒后的乳鼠,发病取肠、脑肝作成20%混悬液。三、HAI法及ELISA判定:参见文献[4]。四、抗血清制备:参见文献[5]。五、兔抗大鼠IgG结合荧光素:由本实验室制备。六、酶标仪:MINIIREADERII七、荧光镜:美国AO八、血球:人'O'RBC-北京市血站提供。人'O,B,AB'型RBC一采自本单位职工。旱公牛血一北京市大红门屠宰公司。水牛血-浙江杭州市提供。九、间接ELISA法:参见文献[2]。十、IFA法:参见文献[5]。结果一、大鼠Reo3病毒抗体阳性临界值的确定依据:取大鼠血清105份,用本试剂盒测OD值,结果见表1。根据文献[4]P/N≥2.1方法计算出阳性临界值为0.47。二、大鼠Reo3试剂盒的特异性试验:取12份大鼠标本用IFA法验证,结果见表2。另取7份大鼠阳性标本与5份大鼠Reo3免疫血清,用试剂盒与HAI法验证,结果见表3。三、大鼠Reo3试剂盒的敏感性试验:取74份大鼠标本,用试剂盒与HAI方法同时进行了检测,结果见表4。四、大鼠Reo3试剂盒的重演性试验:结果五、大鼠Reo3病毒抗体试剂盒的应用:取开放大鼠165只,清洁大鼠10只,用本试剂盒检测,结果见表6。六、Reo3血凝素在BSC-1细胞上繁殖特性:结果见图1。从图1可见,1,2两次培养后所测得的血凝素繁殖曲线,共6瓶,每瓶所测得的血凝滴度高峰均在78小时,若继续培养,除第二次的b’瓶尚能维持96小时,其余5瓶的血凝滴度在78小时后明显下降。七、Reo3血凝素效价与冻融关系:Reo3病毒感染BSC-1细胞9瓶,当收毒后未经冻融测血凝效价,收毒后将培养瓶在-60℃反复冻融3次,分别测血凝,结果见图2。从图2可见,经冻融后血凝素滴度可上升2-4倍。八、Reo3血凝素与血球关系:(1)血球种类与血凝关系:结果见表7。从表7可见,人'O'血球凝集价可达1:5l2,但对公牛及水牛血球无凝集现象。(2)不同个体人'O'型血球与血凝效价关系:取同一份Reo3血凝素用9份不同个体人'O'RBC测血凝效价,结果见表8。从表8可见,最高凝素价为1:64,最低为1:8。各占2份,居中间凝集价1:16～1:32占5份。(3)不同型别的人血球与Reo3血凝关系:取10份人血球,有O型、AB、B型,经用同一份Reo3血凝素测定,结果凡是O型RBC,HA效价均可达到1:64,AB型RBC在1:16～1:32,B型RBC则无血凝。九、Reo3病毒腹腔感染乳鼠测脑、肝、肠血凝素:重复两次结果,仅能测得肠混悬液有血凝素,脑、肝组织内的混悬液则无血凝。讨论我们研制的ELISA法检测实验大鼠Reo3病毒抗体的试剂盒,测定了阴性血清OD值的变动范围,确定了阳性临界值,为了考核本试剂盒的特异性,采用IFA等法对阳性标本进行了验证,敏感性试验检出阳性率比HAI法高一倍,经重复测定,其结果重演性好(见表5)。本试剂盒对165只开放饲养大鼠的检测,发现Reo3病毒抗体阳性率达29%。而清洁大鼠未感染(见表6)。开放饲养大鼠如何避免Reo3病毒的感染,有效措施之一是改善饲养条件,在清洁环境中饲养。该病毒是人畜共患,尤其是各种动物中感染很普遍,它能通过胃肠道传播,也可通过呼吸道扩散,Hobbs氏(6)报道,经滴鼻感染后的鼠肺用IFA法可见到特异性荧光,并用鼠肺悬液测得血凝素效价高达1:32。我们用腹腔感染后的小鼠肠组织悬液血凝素测定为阳性。说明该病毒可以通过多渠道进行传播,本文采用HAl法测Reo3病毒抗体一般在1:12左右(表3)。据Wartley氏(3)介绍这样水平滴度是低抗体,说明该大鼠群以往曾接触过该病毒,属于隐性感染。如果为实验感染,抗体水平要比自然感染高16～32倍,本文实验免疫的大鼠HAI抗体滴度高达1:1536(表3),比自然感染高128倍。关于Reo3病毒血凝素的某些特性的探讨,它与不同种血球的关系据文献(3,6),介绍均用人'O'RBC,但依据文献(1,8)报道可用公牛RBC,它能代替人'O'血球,也有人提出水牛的RBC比人'O'的为好,本文初步测试结果说明公牛、水牛的RBC均不能凝集。为了方便基层单位使用,本文也初步测试了不同个体人'O'RBC对血凝的影响,结果(表8)最高凝集滴度与最低的份数毕竟是少数,滴度居中间的占多数,因人'O'RBC一般不易获得,个体间是有些差异,但不必挑选。据文献[7]报道,使用WI-38,LLc-MK2细胞制备Reo3血凝素比用BSC-l细胞为好,本文采用BSC-l制备血凝素效果尚可。该作者还比较了血凝素滴度与温度关系,指出在24℃-37℃出现凝集为最佳,4℃则无凝集,本文所测血凝均在室温,一般比较理想。为了适合基层应用,如果暂时找不到人'O'RBC时,用AB型RBC亦可,所测得凝集滴度略偏低1～2个滴度。但B型RBC对Reo3血凝素则无凝集。参考文献||1.PakerJc.efal:Nat.CancerInst.Mono1996;20(25):252.吴惠英等:中国人畜共患病杂志1986;2(4):263.Wartleyetal:Proc.Soc.Exper.Biol.Med.1961:l08:3904.杜平主编:医用实验病毒学.人民军医出版社1985;177-1785.WilsnackREetal;J.Exp.Med.1964;120:829-8406.HobbsTRetal:PSEBMn964;118(4):8477.RhimJSetal:PSEBM1965;118(2)453,8478.殷震等主编:动物病毒学科学出版社1982;433THEPREPARATIONANDAPPLICATIONOFELISAKITFORDETECTINGANTIBODYTOREO3VIRUSINRATSANDSTUDYONHEMAGGLUTINATIONPRODUCTIONCONDITIONWuHuiyingWeiLiHeZhengmingZhangRanLiuZuominNationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050[Abstrect]ELisakitwasdevelopedfortheforthedetectionofantibodytoReo3virusinRats,anditsspecificitywasverifiedwithIFAandHItest.ComparedwiththepositiveratesshowedbyKLISAandHI.ELISAwasmoresensitive(18.19)thanHItest(9.45%)Inl65conventionalratsand10clearratstestedbyusingELISAKit,seropositiverateswere29%and0%respectivelyHAtiterofReo3virusantigenwashighabout78hrafterinoculation,andcanbeenhanced2-4timesbyfreezing-thawingSingnificantHAtiterwasobservedinhumantypeat24℃,wherasnoHAindrybovineandbuffulorbccomparisonwithhumanOtype,ABtypeRBCforthetiterofHAproduction,Formerwashigher2-4timesthanthelatter.[Key,Words]:DtectionofABtoReo3virusinrats,ElisA-KitHemagglutinin##61.PakerJc.efal:Nat.CancerInst.Mono1996;20(25):252.吴惠英等:中国人畜共患病杂志1986;2(4):263.Wartleyetal:Proc.Soc.Exper.Biol.Med.1961:l08:3904.杜平主编:医用实验病毒学.人民军医出版社1985;177-1785.WilsnackREetal;J.Exp.Med.1964;120:829-8406.HobbsTRetal:PSEBMn964;118(4):8477.RhimJSetal:PSEBM1965;118(2)453,8478.殷震等主编:动物病毒学科学出版社1982;433##A##BTHE PREPARATION AND APPLICATION OF ELISA KIT FOR DETECTING ANTIBODY TO REO3 VIRUS IN RATS AND STUDY ON HEMAGGLUTINATION PRODUCTION CONDITION Wu Huiying Wei Li He Zhengming Zhang Ran Liu Zuomin National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050 [ Abstrect] ELisa kit was developed for the for the detection of antibody to Reo3 virus in Rats,and its specificity was verified with A and HI test.Compared with the positive rates showed by KLISA and HI.ELISA was more sensitive (18.19)than HI test (9.45%)In l65 conventional rats and 10 clear rats tested by using ELISA Kit,seropositive rates were 29% and 0% respectively HA titer of Reo3 virus antigen was high about 78hr after inoculation,and can be enhanced 2-4 times by freezing -thawing Singnificant HA titer was observed in human type at 24℃,wheras no HA in dry bovine and buffulo rbccomparison with human O type,ABtype RBC for the titer of HA production,Former was higher 2-4 times than the latter.[