滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立

【目的】建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系,有助于滇杨基因工程育种研究。【方法】以滇杨叶片为外植体,研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响,从而获得滇杨再生组培苗;进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。【结果】滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS+0.005 mg·L^(−1)噻苯隆(TDZ)+0.010 mg·L^(−1)萘乙酸(NAA),诱导率达91.7%;不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS+0.002 mg·L^(−1) TDZ+0.010 mg·L^(−1) NAA,诱导率为75.0%;生根最适培养基为1/2 MS+0.010 mg·L^(−1) NAA+0.100 mg·L^(−1)吲哚乙酸(IBA),生根率高达96.7%,平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨,最适转化菌液吸光度D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d;在分化过程中,抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L^(−1),抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L^(−1)。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定,获得20株阳性植株,转化阳性率为45.45%。【结论】本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。

霸王果翅及其浸提液对种子萌发的影响

在室内控制条件下,研究了霸王果翅对其种子萌发及果翅浸提液对霸王、红砂与无芒隐子草3种荒漠植物种子萌发的影响。结果表明:(1)果翅可完全抑制霸王种子的萌发,具有完整果翅的霸王种子萌发率为0;剥去果翅后霸王种子萌发率最高达91%;果翅刺破后其发芽率为40%;而将种子与剥离后的果翅一起培养,其发芽率为88%。(2)果翅浸提液在低浓度条件下(0.025 g/mL)对3种供试种子的萌发率均无显著影响,但高浓度浸提液(>0.025 g/mL)则均显著降低种子萌发率;不同浓度浸提液均显著降低3种种子的萌发速率,对其胚根生长亦存在显著抑制作用;但对胚芽生长的影响则表现为低浓度(0.025 g/mL)具促进作用,而高浓度具抑制作用。研究表明,霸王果翅可引起种子休眠,其浸提液中的萌发抑制物是引起种子休眠的主要方式。

果翅对霸王种子田间萌发的影响

于2007年10月将具有果翅(具翅)和剥去果翅(去翅)的霸王种子埋于阿拉善左旗不同深度(0 cm2、cm、5cm)土壤中,1年内每2月取样1次,调查其萌发情况。结果表明:置于地表具翅种子田间无萌发,而去翅种子在次年6月开始萌发;2 cm埋深具翅种子在次年6月开始萌发,而去翅种子次年2月即能萌发,且其萌发均显著高于同期具翅种子(除10月外);与2 cm埋深相比,5 cm埋深种子萌发较早,其他则表现相似。随埋深的增加和埋藏时间延长,去翅种子田间萌发呈增长趋势,室内萌发率则逐渐减小,而具翅种子除6~10月外田间和室内萌发均逐渐增加。埋藏1年后,去翅种子死亡率显著高于具翅种子,去翅种子为23.0%,而具翅种子为10.0%。可见,果翅可显著抑制霸王种子在田间萌发,有利于种子的田间保存,从而避开不利环境在适宜条件下萌发以获得最佳建植率。

豆科种子休眠破除方法初探

对9种常见豆科植物种的适宜休眠破除条件进行了探索,结果表明,硫酸休眠破除效果最好,但最佳处理时间因种而异,处理时间过长可引致死种子数增多.在采用的60℃、80℃和95℃热水处理中,以80℃效果最好,60℃仅破除少部分种子休眠,而95℃则引致大部分种子死亡;除60℃外,延长热水处理时间可导致死种子数增加.液氮处理效果与种子大小有关,可显著破除苜蓿等小粒种子休眠,对中粒种子如印度田菁的休眠破除没有影响,但显著伤害苦豆子等大粒种子;液氮破除休眠与种子浸入液氮的时间无关.

干旱荒漠区土壤种子库研究进展

荒漠生态系统是地球上最脆弱的生态系统。近年来,荒漠生态系统保护和恢复的研究已受到广泛关注。土壤种子库作为种子源,在植被恢复过程中起着至关重要的作用。本研究系统回顾了近20年来国内外对干旱荒漠区土壤种子库的研究进展,从土壤种子库的基本特征、时空分布、与地上植被的关系、研究方法以及影响因素等方面进行综述并提出研究展望。

麻疯树油质蛋白JcOle14.3基因克隆及序列分析

作为最丰富的油体结合蛋白,油质蛋白在油体的发生到分解消失过程中起着重要的生物学功能。本实验应用生物信息学和分子生物学技术分离克隆了麻疯树Jatrophacurcas全长593 bp的油质蛋白JcOle14.3基因序列,无内含子结构。JcOle14.3基因转录的m RNA包含了完整的开放阅读框,推测编码由137个氨基酸残基组成、相对分子质量为14.3 k D的稳定、两性的油质蛋白JcOle14.3。JcOle14.3理论等电点为9.65,正电荷残基(Arg+Lys)总数为10个,负电荷残基(Asp+Glu)总数为6个;不稳定系数为25.90,属于稳定性蛋白;其二级结构的主要构件为α-螺旋、随机卷曲和延伸链。根据高级结构预测结果推测JcOle14.3含有N-末端两亲性结构域、中间疏水性结构域以及C-末端两亲性结构域。C-末端两亲性结构域包含1个α-螺旋结构域,中间疏水性结构域包含由3个α-螺旋构成的跨膜结构域,并具有oleosin蛋白特征性的高度保守的脯氨酸结模体,推测在oleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上起着重要的作用。该研究为后期JcOle14.3的异源表达和功能研究奠定了基础。

不同水分条件下苦豆子种子产量及其构成因素研究

对田间不同水分条件下苦豆子(Sophora alopecuroides)种子产量及其构成因素进行了研究,结果表明:苦豆子种子产量高达1 806 kg/hm2。水分是影响苦豆子种子产量的主要因素,其中降低生殖枝分化率及抑制生殖枝的生长是水分控制苦豆子有性繁殖的2个主要途径。研究还表明,在干旱生境中,苦豆子有性繁殖与无性繁殖存在显著竞争,而在水分充足条件下,则其竞争性减弱。这一研究结果对控制苦豆子种群的扩散及危害有一定价值。

番茄DDB2蛋白的生物信息学分析、亚细胞定位及在E3复合体中的相互作用关系

紫外(UV)辐射诱导的DNA损伤可导致农作物减产。DDB2蛋白参与由紫外辐射造成的DNA损伤的修复过程已经在人类、水稻和拟南芥中得到证实。DDB2与DDB1、CUL4相互作用形成E3泛素连接酶复合体,该复合体对植物根茎生长、花期调控和光形态建成等多种植物发育过程起调控作用。成功克隆了番茄DDB2基因,构建了DDB2-黄色荧光蛋白融合表达载体。通过对野生型番茄UV辐射后DDB2基因表达水平的半定量分析,证明番茄DDB2基因受UV诱导表达;运用生物信息学分析对DDB2蛋白序列与模式生物进行同源比对,发现2个WD-40重复和一个DWD盒保守结构域;通过对DDB2融合黄色荧光蛋白转基因番茄根尖的荧光显微观察,证实番茄DDB2定位于细胞核。利用酵母双杂交实验证明了番茄DDB2与DDB1和CUL4之间的相互作用关系,推测DDB1蛋白作为DDB2与CUL4蛋白的桥梁形成CUL4-DDB1-DDB2复合体。

不同来源牛枝子种子硬实破除方法的研究

采用浓硫酸、热水和液氮3种人工破除硬实技术,在室内模拟牛枝子适生地水热条件,对2007、2008年采自内蒙古阿拉善左旗和2008年甘肃榆中栽培的牛枝子种子进行处理,以探讨同一种群不同年份和非种源地栽培一年后的牛枝子种子的硬实程度及其破除的最佳方式。结果发现：（1）采自阿拉善左旗（2007、2008年）和甘肃榆中的牛枝子初始硬实率存在显著差异,分别为98%、93%和86%。（2）阿拉善左旗和甘肃榆中的牛枝子种子对硫酸、热水和液氮处理的响应不同,浓硫酸处理的效果显著优于其它2种方法,普遍适宜于所有种批的最佳浓硫酸处理时间为25-30 min。（3）模拟温度和湿度处理表明,高温（60℃,60/20℃）和5%湿度的环境是牛枝子种子硬实破除的关键环境因素。

麻风树油质蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析

分离克隆麻风树油质蛋白基因家族成员Jc Ole16.6基因的DNA序列(Gen Bank序列号为JX073622.1)。Jc Ole16.6基因全长601 bp,没有内含子,转录的Jc Ole16.6 mRNA具有468 bp的完整开放阅读框,编码含155个氨基酸残基、分子量为16.6 ku、等电点为9.99的Jc Ole16.6蛋白(Gen Bank序列号为AFP19884),属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。Jc Ole16.6属于稳定的两性蛋白质,具有3个结构域,即N端约30个氨基酸残基组成的含1个α-螺旋的亲水性结构域,肽链中间约78个氨基酸残基组成的含3个α-螺旋的高度疏水性跨膜结构域,C端约47个氨基酸组成的含1个α-螺旋的两亲性结构域。N端亲水性结构域和C端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆一面,中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内,存在于中间疏水跨膜结构域中的由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域在Jc Ole16.6蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。研究结果为Jc Ole16.6基因表达调控和生理功能等研究奠定了基础。

林科类专业《生物化学》课程教学改革与实践

为了使生物化学课堂教学更好地适应社会及地方经济对林业人才培养的需要,项目组开展了林科类专业《生物化学》课程教学改革与实践的研究,在生物化学教学内容、教学方法和学法指导等方面进行了一系列改革与尝试,合理的教学内容和新型的教学方法激发了学生的学习兴趣,也使学生逐步养成了发现问题、提出问题、解决问题的学习习惯,为应用型林业科技人才的培养奠定了良好的基础。

种胚特异性表达番茄SlABI3对水稻冈46B穗萌的抗性研究

【目的】利用水稻胚特异表达基因OsVP1的启动子驱动与OsVP1同源的番茄SlABI3在穗萌严重的水稻保持系冈46B中表达,以增强冈46B对穗萌的抗性,进而为改良水稻穗萌抗性的分子设计育种提供理论依据。【方法】构建SlABI3的胚特异表达载体pHB-OsVP1P::SlABI3,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入籼稻冈46B中,通过研究转基因和野生型植株的穗萌差异,验证种胚特异表达的SlABI3在穗萌抑制中的生理功能。【结果】获得了pHB-OsVP1P::SlABI3转冈46B的转基因植株;转基因植株种子的萌发速率较野生型冈46B慢,并且萌发后第8天转基因植株的苗长、根长显著(P<0.05)短于野生型冈46B;此外,在不同浓度ABA处理的试验中,随着ABA浓度的升高,转基因和野生型种子的萌发速率都呈现下降的趋势,但转基因种子的萌发速率均比野生型种子慢。【结论】SlABI3在水稻胚中特异表达能够降低种子的萌发速率并且抑制穗萌发生。

UGPase与USPase编码基因在滇杨正、倒扦插苗中的组织特异性表达

细胞壁对植物生长发育发挥着重要调控作用,而UDPG是植物细胞壁合成的主要前体物质,主要来源于UGPase和USPase催化葡萄糖-1-P和UTP生成。利用生物信息学软件和在线网站对滇杨PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因编码蛋白进行预测和分析,同时以1年生滇杨正、倒扦插苗为材料,测量其主枝长度和主枝粗度,并对3个目标基因在茎尖、嫩叶、成熟叶、茎和根中表达量进行RT-qPCR分析,探究PyUGPase和PyUSPase基因在滇杨正、倒扦插苗中的组织特异性表达规律,从而为揭示PyUGPase和PyUSPase基因调控细胞壁合成进而调控滇杨生长的机制提供依据。结果表明:PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因全长和编码的氨基酸分别为1410 bp和469个氨基酸、1410 bp和469个氨基酸、1875 bp和624个氨基酸;3个蛋白均不存在信号肽和跨膜结构域,且均定位于细胞质内的一种亲水稳定性蛋白酶;PyUGPase和PyUSPase基因编码的氨基酸序列和其他植物UGPase和USPase基因编码的氨基酸序列相似性达85%以上。倒扦插苗的主枝长度和粗度均低于正扦插苗,但差异不显著。PyUGPase-A和PyUGPase-B基因在2种类型扦插苗的成熟叶中表达量相对较高,但在倒扦插苗的嫩叶中上调表达;而PyUSPase基因在正、倒扦插苗的根中表达量较高,且在5个组织中均呈现下调表达。

7个候选内参基因在樟叶越橘不同组织中的表达及稳定性分析

【目的】筛选樟叶越橘不同组织部位基因表达分析的最适内参基因。【方法】基于樟叶越橘三代转录组测序数据,筛选出PP2A-1、PP2A-2、EIF-4A-1、EIF-4A-2、60S-1、60S-2和ARP-1共7个候选内参基因;利用qRT-PCR技术对目标基因在樟叶越橘不同组织(嫩叶、成熟叶、花芽、花、绿色果实、红色果实、绿果果梗和红果果梗)的表达水平进行检测,应用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法分析评估基因表达的稳定性,通过RefFinder方法综合评价以筛选出樟叶越橘不同组织的最适内参基因;以樟叶越橘绿原酸合成途径中苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的组织表达情况验证内参基因稳定性评价结果的可靠性。【结果】樟叶越橘的不同组织中,60S-2基因表达的稳定性居于首位,其次是PP2A-2基因,ARP-1、60S-1和EIF-4A-2基因表达的稳定性居中,EIF-4A-1基因表达的稳定性最差。应用60S-2内参基因分析获得的樟叶越橘不同组织中PAL基因表达量与绿原酸含量的变化趋势一致,表明PAL基因参与了樟叶越橘体内绿原酸的合成。【结论】供试的7个候选基因中,能在樟叶越橘不同组织最稳定表达的内参基因是60S-2。研究结果为后续其他功能基因在该植物不同组织中的表达研究提供了最适内参基因选择参考。

麻疯树种子发育过程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达模式研究

油质蛋白基因对种子中油体的形成至关重要,该研究通过实时荧光定量PCR,对麻疯树的两个油质蛋白基因JcOle14.3和JcOle16.6在种子不同发育时期的表达模式进行了分析。结果表明:两个基因在种子发育初期(10~30 d)表达量逐渐升高,但表达水平均较低;40 d时表达量急剧增加并达到最高,而种子发育后期(50~55 d)两个基因表达水平均逐渐降低。由此可初步推测,JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达量可能与种子油脂积累量存在正相关。该研究结果为麻疯树油体形成机理和油质蛋白的深入研究提供了理论基础。

重寄生枝孢菌的鉴定及转录组学分析

从感石楠叶锈病病菌的球花石楠叶片上获得的3株重寄生菌SYC4、SYC23和SYC63,为确定其分类地位及在锈菌孢子诱导下菌丝体基因的表达情况,采用形态学特征结合分子序列分析将菌株鉴定到种,并对重寄生效果较好的菌株SYC63进行转录组测序。结果表明,经鉴定SYC4、SYC23为Cladosporium anthropophilum,SYC63为枝状枝孢菌(C.cladosporioides)。对菌株SYC63获得的转录组数据与不同数据库进行比对,在Nr数据库中有11002个基因被注释到,除其他物种外,枝孢菌SYC63与南极枝孢菌(Rachicladosporium antarcticum)有2130个基因相似,所占物种匹配最高;在GO数据库中注释到8088个基因,基因数量最多的是生物学过程,其次是分子功能和细胞组分。在差异表达基因中发现,与重寄生相关的凝集素、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及抗性次级代谢物有关的基因经锈菌孢子诱导后显著上调表达。以上研究为重寄生枝孢菌在植物病害的生物防治应用中提供了菌株来源,并为其重寄生机制的深入研究提供了理论基础。

重寄生拟盘多毛孢cr013菌株聚酮合酶基因的多样性分析

本研究通过基因组挖掘的方式首次从重寄生拟盘多毛孢cr013菌株中获得了聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因,并利用NCBI、CDD、Clustal W、MEGA 7.0等生物信息软件对获得的PKS基因进行功能预测,挑选相似性较高、结构和功能已知的非还原型crPKS3基因和还原型crPKS12基因检测在改良Fries培养基上5个不同时间段(4、8、12、16、20 d)的基因表达情况,为重寄生拟盘多毛孢中还原型聚酮类化合物生物合成机制的阐明奠定基础。结果发现,经过全基因组数据和生物信息学分析挖掘到28个PKS(编号:crPKS 1~28)基因,包括14个HR-PKS,4个PR-PKS,8个NR-PKS和2个杂合的NRPS/PR-PKS。PKS蛋白聚类分析结果显示,推测crPKS10、crPKS25和crPKS27可能参与了美伐他汀(compactin)的生物合成;crPKS19、crPKS12、crPKS26、crPKS13、crPKS11、crPKS23、crPKS28可能参与洛伐他汀(lovastatin)生物合成;crPKS3可能参与pestheic acid的生物合成;crPKS1可能参与黑色素(melanin)的生物合成;crPKS4、crPKS8可能参与黄色分生孢子色素(yellow conidial pigment)的生物合成;crPKS20可能参与富马霉素(fumagillin)的生物合成;其余PKS蛋白序列因未聚到已知功能的分支,无法推测其催化的化合物。实时荧光定量PCR结果显示:两条PKS基因均在改良Fries培养基培养第16 d时,基因表达量最高,但crPKS12的表达量为21.72,crPKS3的表达量为12.19,crPKS12的表达量远高于crPKS3。本研究结果为重寄生拟盘多毛孢PKS基因的功能鉴定和开发利用提供理论依据,推测还原型crPKS12基因可能参与了重寄生菌cr013中聚酮的生物合成,这为该基因的克隆表达及进一步功能研究奠定了基础。

基于中华猕猴桃“红阳”转录组序列开发EST-SSR分子标记(英文)

为开发猕猴桃EST-SSR标记,了解28个品种猕猴桃间的遗传多样性和遗传关系,对中华猕猴桃"红阳"的转录组序列进行分析,并根据分析结果设计SSR引物.之后采用CTAB法提取28个品种猕猴桃的DNA作为SSR-PCR的扩增模板,并根据扩增结果进行聚类分析.研究中共得到包含SSR的序列21 848条,其中重复单元为单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的序列分别为1 642、15 965、3 141、248、368和484条,随机选择其中46条序列设计SSR引物.根据初步的PCR扩增,筛选出32对条带较少且明亮的引物分别对28个品种猕猴桃的DNA样本进行扩增,并对引物对应的SSR序列进行定位.结果显示,32对引物对应的序列中有19条能够得到完整的所在基因、染色体以及染色体中具体位置的信息.这些引物中有26对具有多态性,共统计到等位基因120个,每对引物得到1-11个等位基因,平均3.75个.28个猕猴桃品种之间的遗传相似性系数在0.53-0.97之间,在遗传相似系数为0.72的水平上,可将它们分为5大类,分类结果与传统形态学的划分基本一致.本研究揭示的各样本间的遗传关系可为未来猕猴桃的种质改良提供依据.

利用RNAi沉默技术对水稻OsHAD1基因的功能分析

生物信息学分析推测了水稻OsHAD1基因属于HAD(haloacid dehalogenase)超级家族水解酶.为研究其功能,本实验设计构建了OsHAD1-RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻,成功获得了转基因植株.结果表明,转基因植株与野生型(日本晴)相比,转基因植株从T0代到T2代结实率均有20%～50%的降低;实时荧光定量PCR分析显示,T2代独立转基因植株中OsHAD1基因的表达量均有50%以上的下调;花粉染色结果显示,转基因植株花粉染色异常,败育率高,平均败育率达71.19%;石蜡切片结果显示,转基因植株花粉形状不规则,在花粉囊中排列松散,并且植株表现出明显的雄性不育.因此,推测OsHAD1基因参与水稻的生殖发育.

番茄SlWRKY80基因共抑制表达影响转基因植株抗逆性的研究

利用植物基因工程技术,构建了植物表达载体pBI121-35S::SlWRKY80,并利用根癌农杆菌介导法转化番茄,得到转基因阳性植株.通过生物信息学分析SlWRKY80蛋白序列与9种物种进行同源比对,发现高度保守的WRKY结构域和C2HC型锌指结构.采用Real-Time PCR分析转基因植株中SlWRKY80mRNA的表达情况,结果显示SlWRKY80的表达量显著下调,出现共抑制现象.用不同浓度的NaCl对转基因种子和野生型种子进行胁迫处理,结果显示在NaCl浓度为100mM和150mM时,转基因幼苗初生根的长度与野生型相比相对较短,显示SlWRKY80对初生根的生长有促进作用;用Pto DC3000接种转基因植株和野生型植株叶片,结果显示野生型植株叶片中细菌增殖率是转基因植株叶片中的2.5倍,显示SlWRKY80在番茄抗病信号转导中扮演负调控作用.