基于全基因组测序的弯曲菌食物中毒事件的病原学研究

目的对深圳地区一起疑似弯曲菌引起的食物中毒事件进行病原菌全基因组测序分析,了解本地区引起食物中毒的弯曲菌的病原特征。方法采集食物中毒病例肛拭子样本和可疑食品样本,用双孔增强过滤法进行弯曲菌分离,用微生物质谱系统进行鉴定,对分离到的弯曲菌用琼脂稀释法进行抗生素敏感性分析。用illumina二代测序方法进行菌株的全基因组测序,将菌株序列与Resfinder、CARD、MLST和VFDB数据库比对,分别获得耐药基因、ST型和毒力因子。用K-mer tree方法绘制系统发育树。结果共分离到17株弯曲菌,其中12株空肠弯曲菌,5株结肠弯曲菌,均来源于病人。17株菌均携带flaA、cadF、cdtA、cdtB、cdtC等毒力基因。药敏结果显示空肠弯曲菌耐药率最高的是四环素(100%),其次是萘啶酸(91.67%)、环丙沙星(83.34%)和庆大霉素(58.33%)。58.33%(7/12)的空肠弯曲菌中具有多重耐药。80%(4/5)的结肠弯曲菌对除了氯霉素类、林克酰胺类外的其它抗生素均耐药,100%的结肠弯曲菌存在多重耐药。100%的弯曲菌携带四环素类、β-内酰胺类耐药基因和gyrA基因点突变,76.47%(13/17)的弯曲菌携带氨基糖苷类耐药基因。MLST结果显示空肠弯曲菌分为6个ST型,ST-12294(6/12)、ST-12295(1/12)、ST-12296(1/12)是新发现的ST型,其中ST-12294与2021年克罗地亚地区的人源分离株、2018年深圳地区的鸡源分离株高度相关。结肠弯曲菌均为ST-828型,归属ST-828 complex,与2018年深圳蛇口市场鸡源分离株高度相关。结论本次是一起ST-12294型空肠弯曲菌和ST-828型结肠弯曲菌混合感染引起的食物中毒事件。弯曲菌多重耐药率高,需要引起重视。

抗华支睾吸虫噬菌体抗体库的构建

目的 构建抗华支睾吸虫噬菌体抗体库 ,以期筛选出抗循环抗原的抗体组合。方法 应用噬菌体表面呈现技术 ,从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA后 ,用相应引物 PCR扩增出重链 Fd和轻链基因 ,经 Xho 和 Spel、Sac 和 Xba 双酶切 ,先后克隆入噬粒载体 p Comb3,再电转化大肠杆菌 XL1- blue菌株 ,辅助噬菌体 VCSM13超感染。结果 从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中扩增出约 70 0 bp重链 γ1 、γ3Fd段和轻链 κ、λ基因 ,分别和 p Com b3连接后成功导入 XL 1- blue,得到滴度为 7.5× 10 1 0 cfu/ ml,库容量为 5 .6× 10 6 噬菌体抗体库。结论 抗华支睾吸虫 Fab段噬菌体抗体库的构建 ,为进一步筛选抗华支睾吸虫循环抗原单克隆抗体奠定了基础。

ITP患儿血清可溶性IL-2受体水平和T淋巴细胞亚群变化

探讨特发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患儿免疫功能变化。方法采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法对ＩＴＰ患儿进行了血清可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）测定和ＡＰＡＡＰ法检测Ｔ淋巴细胞亚群。结果ＩＴＰ患儿血清ｓＩＬ－２Ｒ、ＣＤ８显著升高，ＣＤ４／ＣＤ８显著下降（Ｐ＜０．０１），且ｓＩＬ－２Ｒ和ＣＤ４／ＣＤ８呈负相关（ｒ＝－０．５８１，Ｐ＜０．０１）；缓解期ｓＩＬ－２Ｒ明显下降，基本接近正常水平，而ＣＤ８、ＣＤ４／ＣＤ８比值较急性期变化不明显。

食管癌患者手术前后血清可溶性白细胞介素-2受体动态观察

为探讨食管癌患者手术前后细胞免疫功能的变化，采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测了５４例食管癌患者手术前后血清ｓＩＬ－２Ｒ水平，结果表明：ｓＩＬ－２Ｒ显著高于正常人，且随肿瘤分期增加而增高。手术治疗１个月、３个月后，ｓＩＬ－２Ｒ均有明显下降，但有转移的患者降低不明显。术后１周ｓＩＬ－２Ｒ变化不明显，可能与机体的应激反应有关。提示血清ｓＩＬ－２Ｒ可作为食管癌患者免疫功能的监测指标之一。对疾病的临床分期、疗效和预后的判断也有一定的帮助。

人源性抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库的构建

应用噬菌体表面呈现技术,从腮腺炎病毒抗体阳性者淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增出抗体重链Fd和轻链基因,经XhoI/SpeI、SacI/XbaI双酶切,先后克隆入噬粒载体pComb3中,再电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染。从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700 bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5 kV、200 Ω、25μF的条件下电转化,转化率为2.48×107。最终得到库容量为6.4×106,滴度为7.8×1013 cfu/L的噬菌体抗体库。所构建的抗腮腺炎病毒特异性噬菌体抗体库容量中等大小,能满足从中筛选抗HN蛋白噬菌体抗体的需要。

抗华支睾吸虫CAg噬菌体抗体表达与活性鉴定

目的 对从抗华支睾吸虫噬菌体抗体库中筛选到的阳性克隆进行诱导表达和鉴定。方法 对阳性克隆株B0 5、C10和E38用异丙基 - β -D -硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)和蛋白印迹试验 (Westernblot)观察有无Fab抗体条带。然后 ,用卫氏并殖吸虫 (Pw)、肝片吸虫 (Fh)、姜片吸虫 (Fb)、华支睾吸虫 (Cs)、日本血吸虫 (Sj)脱脂全虫粗抗原和华支睾吸虫代谢抗原 (Cs-MAg)进行SDS -PAGE ,并分别和B0 5、C10和E38噬菌体抗体进行Westernblot,鉴定抗体活性。结果 Westernblot结果表明 ,3株阳性克隆的培养上清和细菌冻融上清在约 5 0kD和 2 7kD处均有特异抗体条带出现。B0 5噬菌体抗体与Cs-MAg和Cs-Ag在约 2 5kD处出现特异性反应条带 ,而与其它 4种吸虫抗原无反应条带的出现。C10除与Cs-MAg和华支睾吸虫全虫抗原 (Cs -Ag)在约 38kD处出现反应条带外 ,还与Sj-Ag在该处有弱阳性反应 ;而与其它 3种吸虫抗原无反应条带出现。E38与Cs-MAg和Cs-Ag在约 16kD处出现特异性反应条带 ,而与其它 4种吸虫抗原无反应条带出现。 结论 3株阳性克隆均可表达抗华支睾吸虫循环抗原 (CAg)噬菌体抗体 ,其中B0 5和E38具有特异结合Cs-CAg活性。

一株抗腮腺炎病毒Fab抗体克隆的筛选

[目的]获得抗腮腺炎病毒Fab段基因工程抗体。[方法]将腮腺炎病毒抗原(MUV-Ag)包被在固相ELISA板中,采用"吸附-洗脱-扩增"的方法,对已构建的抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库进行富集。从富集后的抗体库中筛选抗腮腺炎病毒阳性克隆,并交叉筛选鉴定其特异性。[结果]在对176个克隆筛选后,再用麻疹病毒抗原(MEV-Ag)、混合副流感病毒抗原(mPIV-Ag)和呼吸道合胞病毒抗原(RSV-Ag)进行交叉筛选,最终获得特异性抗MUV-Ag阳性克隆2个(B206和D210)。对其中1株B206序列分析表明它的κ轻链V基因属于VκⅠ(O12)亚群,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于VH1-69亚群,D基因来自D3-10,J基因则来自JH6。[结论]用腮腺炎病毒抗原成功地从抗体库中筛选到特异性阳性克隆,构建的噬菌体抗体库是有效的。

病毒性肺炎患儿血清可溶性白细胞介素2受体测定及意义

采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测了４８例病毒性肺炎患儿血清ｓＩＬ－２Ｒ水平。结果表明：病毒感染急性期，ｓＩＬ－２Ｒ水平显著升高（Ｐ＜０．０１），恢复期则显著降低（Ｐ＜０．０１），但仍高于正常水平（Ｐ＜０．０５）。患儿ｓＩＬ－２Ｒ水平的高低与感染的病毒类型无关。提示对病毒性肺炎患儿血清ｓＩＬ－２Ｒ水平的动态观察对监测患儿的病情、疗效及转归有一定的积极意义。

食管癌患者血清sIL2R和IgE水平的动态观察

对４７例食管癌患者进行手术前后血清ｓＩＬ２Ｒ和ＩｇＥ的检测。结果表明：ｓＩＬ２Ｒ和ＩｇＥ水平显著高于正常人，且随肿瘤分期增加而增高。手术治疗３个月后，ｓＩＬ２Ｒ和ＩｇＥ均有明显下降，但有转移的患者降低不明显。ｓＩＬ２Ｒ和ＩｇＥ在食管癌病人中呈正相关，提示血清ｓＩＬ２Ｒ和ＩｇＥ可做为食管癌患者免疫功能的监测指标之一，同时，对疾病的临床分期。

巨细胞病毒单克隆抗体的研究进展

自Ｐｅｒｅｉｒａ等１９８２年制备出巨细胞病毒单克隆抗体以来，国内外学者先后建立了多种不同性质的巨细胞病毒单克隆抗体。本文概述了这些单克隆抗体在巨细胞病毒的预防、诊断方面的应用，以及对巨细胞病毒的生物学特性和致病机理的研究。

不同脂肪酸构成比食用调和油对高脂血症患者血脂代谢的影响

目的 :观察不同脂肪酸构成比 (饱和∶单不饱和∶多不饱和 )食用调和油对高脂血症患者血脂代谢的影响。方法 :6 2名年龄 4 0～ 70岁的高脂血症患者随机分成 3组 ,分别使用脂肪酸构成比为 0 .2 7∶ 1∶ 1 ( 组 )、 0 .2 7∶ 0 .6 0∶ 1 .4 0( 组 )和 0 .2 7∶ 0 .4 4∶ 1 .5 6 ( 组 )的食用调和油共 1 2周 ,在实验前和实验后每隔 4周抽取外周静脉血检测 TG、 TC、 HDL- C、 L DL - C、 Apo AI和 Apo B。结果 :实验第 1 2周后 TG、 TC和 L DL - C水平在 、 组中明显下降 (P<0 .0 5 ) ; 、 组第 8、 1 2周 TG、 TC和 L DL - C水平较实验前下降值与 I组相比差异皆有显著性 (P<0 .0 5 ) ,而 、 组间下降差异无显著性 ;第 1 2周后 HDL - C和 Apo AI水平在 组中降低明显 (P<0 .0 5 ) ,和 、 组比较差异有显著性 (P<0 .0 5 )。另外 ,Apo B水平和 Apo AI/ Apo B比值在 3个组中的变化差异均无显著性。结论 :脂肪酸构成比为 0 .2 7∶ 0 .6 0∶ 1 .4 0的食用调和油对高脂血症患者具有较好的降脂效果。

广州管圆线虫成虫cDNA文库构建

目的 构建广州管圆线虫成虫cDNA文库。方法 提取广州管圆线虫成虫总RNA ,用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA ,然后通过长距离PCR方法合成双链cDNA并扩增 ;PCR产物与λTripIE× 2载体连接并包装 ,建成未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库扩增及测定扩增文库的滴度。结果 经测定 ,未扩增文库滴度为 9 7× 1 0 6 pfu/ml,重组效率达 99 2 %以上 ,文库扩增后滴度达 9 1 3× 1 0 9pfu/ml。

铜绿假单胞菌耐药基因分析及多位点序列遗传分型

目的了解2011-2012年深圳市南山区医院病人,各医院、诊所内环境台面涂抹样、医护人员手涂抹样分离的铜绿假单胞菌,抗生素耐药基因分布及基因的遗传多样性。方法采用聚合酶链反应技术检测铜绿假单胞菌的20种耐药基因:TEM、VEB、CARB、OXA、SHV、PER、GES、GTX、SPM、GIM、IMP、VIM、DHA、oprD、Aac(6′)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ、qacE1-sull及Ⅰ类整合子基因。采用多位点序列分子分型方法进行聚类和克隆分析。结果检出11种耐药基因:TEM、SHV、IMP、DHA、Aac(6’)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ、qacE1-sull、Ⅰ类整合子及oprD基因,检出率分别为8.1%、6.4%、4.8%、9.7%、4.8%、14.5%、4.8%、56.5%,8.1%,8.1%,oprD基因缺失率为61.2%。52株铜绿假单胞菌检出耐药基因,形成19种耐药基因谱。多位点序列分型方法将62株铜绿假单胞菌,分为39个ST型,5个克隆群,1个优势克隆群CC244,1个优势独特型ST856。结论不同类型样本分离菌株携带耐药基因存在差异,部分病人分离株携带多种耐药基因。本研究铜绿假单胞菌具有遗传多样性,存在优势克隆群。

三氯乙烯职业中毒皮肤损害与HLA-DR、DQ基因相关性研究

[目的]从HLA-DR、DQ基因角度探讨三氯乙烯职业中毒皮肤损害易感的遗传背景。[方法]采用PCR- SSP(sequence specific primer)法对三氯乙烯职业中毒皮肤损害组(病例组)及对照组进行HLA-DR、DQ基因位点等位基因分型。[结果]HLA-DRB1位点在病例组检出11个等位基因,11个血清型;对照组检出13个等位基因,13个血清型。HLA-DQB1位点在病例组及对照组均检出5个等位基因,7个血清型。获得了各等位基因分布及基因频率资料,其中DRB1*09(DR9)和DQB1*03(DQ9)等位基因频率在病例组与对照组间差异均有显著性(P<0．05);OR值(95％可信区间)分别为DRB1*09(DR9)等位基因为0．174(0．037～0．830),DQB1*03(DQ9)等位基因为0．226(0．046～1．108)。[结论] DRB1*09(DR9)和DQB1*03(DQ9)等位基因可能是三氯乙烯职业中毒皮肤损害的保护基因。

2018-2021年南山区食物中毒中肠炎沙门氏菌与布利丹沙门氏菌遗传特征和耐药性分析

目的分析2018-2021年南山区食物中毒样品中分离的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis S.Enteritidis)与布利丹沙门氏菌(Salmonella Blegdam.S.Blegdam),从遗传特征和耐药性角度了解细菌间的亲缘进化关系和耐药特征、为食源性疾病暴发溯源和临床诊治提供参考依据。方法分别对33株沙门氏菌采用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)与全基因组序列方法(Whole genome sequencing,WGS)分析,同时测定30种药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。结果33株菌分为8个PFGE型别,MLST型均为ST11型。全基因组k-mer系统发生树可见9簇。氨苄西林(AMP)、头孢唑啉(CFZ)、萘啶酸(NAL)、磺胺异噁唑(Sul)4种抗菌药物的检出率较高,均大于50%。20株菌对3类以上的药物耐药(60.60%),属于多重耐药,7株菌产ESBL酶。15株菌的耐药基因与耐药表型完全符合。结论2018-2021年,南山区由沙门氏菌引起的食物中毒事件中,沙门氏菌的总体遗传距离较近,但与数据库中其它肠炎沙门氏菌遗传距离较远,自成一簇。本研究中的沙门氏菌多重耐药现象严重,需加强对多重耐药株的监控及抗菌药物使用的监管。

市售海产品副溶血性弧菌污染状况调查

目的了解本地区海产品副溶血性弧菌的污染情况,为预防由海产品引起的细菌性食物中毒及溯源工作提供参考,对结果作统计分析。方法随机抽取市售海产品200份按国家标准GB/T-4789-2003[1]及《卫生防疫细菌检验》[2]操作规程进行副溶血性弧菌分离培养及鉴定。结果在200份样品中检出105株副溶血性弧菌,检出率为52.5%。其中鱼类检出率67%,虾类检出率60%,贝类检出率16%。检出副溶血性弧菌的血清学分型(群),以O3群居多,占19.0%(20/105),其次为O4、O11、O1群,未定群有32株占30.5%,K抗原未检出细菌性食物中毒常见的O3:K6型流行株。结论本地区海产品副溶血性弧菌存在着严重污染,以O3群居多。

深圳市南山区人群华支睾吸虫感染现状调查

目的了解深圳市南山区各类人群华支睾吸虫感染现状。方法采用整群抽样方法调查不同类型人群,使用“肝吸虫抗体检测试剂盒”,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清华支睾吸虫IgG抗体。结果共调查5185人,华支睾吸虫感染率5.77%。其中,机关事业单位工作人员感染率为6.47%,本地企业员工感染率为3.04%,外来务工人员感染率为1.59%,主动检测人员感染率为32.26%。男性感染率高于女性,40岁年龄组感染率最高。结论本地区属于华支睾吸虫感染的低流行区,机关事业单位工作人员是重点防治人群,应加强宣传教育,同时做好食品卫生整治工作,切断华支睾吸虫的感染来源。

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和鉴定

目的 构建抗日本血吸虫噬菌体抗体文库 ,以探索制备日本血吸虫病诊断用单克隆抗体的新方法。方法 用文库构建试剂盒 ,以日本血吸虫感染小鼠脾脏为材料 ,建立噬菌体抗体文库 ,并对其进行鉴定。结果 构建完成了一滴度为6 42× 10 10 cfu/ml的噬菌体抗体库。结论 日本血吸虫噬菌体抗体库的建立为对文库进行进一步的筛选。