以PD_(20)-PEF和PD_(20)-FEV1作为气道反应性判定指标的比较分析

为探讨以 PD2 0 - PEF替代 PD2 0 - FEV1作为气道反应性判定指标的可行性 ,对 6 4例有呼吸系统症状者和 6 2例无症状者进行乙酰甲胆碱支气管激发试验 ,同步记录 PEF和 FEV1,计算 PD2 0 - PEF和 PD2 0 - FEV1。虽然 PD2 0 - PEF和 PD2 0 - FEV1之间有较强的直线相关关系 (P<0 .0 0 1) ,但两者之间有显著差异 (P<0 .0 0 5 ) ;若以 PD2 0 - FEV1作为金标准 ,在有症状组中以 PD2 0 - PEF作为气道反应性判定指标的敏感性 (72 .7% )、特异性 (73.8% )、阳性符合率(5 9.3% )、阴性符合率 (83.8% )均不甚高 ;在无症状组中敏感性 (6 6 .7% )和阳性符合率 (40 .0 % )仍低 ,而特异性(89.2 % )和阳性符合率 (96 .2 % )较高。认为 PD2 0 - PEF作为无症状群体的流行病学筛选指标以除外气道反应性正常者可能具有一定价值 ,但替代 PD2 0 -

细胞外信号调节激酶活化在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用(英文)

本文旨在探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(airwaysmooth muscle cells, ASMCs)增殖中的作用。建立慢性哮喘大鼠模型,用 ERK 激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和抑制剂 PD98059 干预慢性哮喘大鼠 ASMCs 的培养。采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、3H-thymidine (TdR)掺入法和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)免疫组织化学法检测ASMCs增殖情况,观察ERK信号通路对ASMCs 增殖的影响。RT-PCR 和 Western blot 检测 ERK mRNA 和 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2 (p-ERK1/2)蛋白的表达。与正常对照组ASMCs 比较,慢性哮喘组ASMCs 的 G0/G1 期细胞所占比例明显减少,S+G2/M 期细胞所占比例增高;吸光度(A490)值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量均明显增加,ERK mRNA、ERK1/2 蛋白、p-ERK1/2 蛋白的表达量以及ERK 活化率显著增高。经PD98059 干预之后,慢性哮喘组ASMCs 的 S+G2/M 期细胞所占比例、A490 值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1/2 蛋白、p-ERK1/2 蛋白的表达量以及ERK 活化率显著降低。经EGF 干预后,慢性哮喘组ASMCs 的 S+G2/M 期细胞所占比例、A490 值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059 抑制。以上结果提示,慢性哮喘大鼠ASMCs 内源性增殖活性增加,ERK1/2 参与其增殖活性的调控,ERK 信号通路在哮喘气道重建的ASMCs 增殖调控中具有重要作用。

蛋白激酶C对大鼠支气管平滑肌K_V通道的影响

用全细胞膜片钳、Western印迹法和逆转录 PCR技术 ,观察蛋白激酶C ( proteinkinaseC ,PKC)对大鼠支气管平滑肌细胞 (bronchialsmoothmusclecells,BSMCs)电压依赖性延迟整流钾通道 (KV)活性及其亚型KV1 5表达的影响。结果为 :( 1)PKC激活剂豆蔻酰佛波醇乙酯 (phorbol 12 myristate 13 acetate ,PMA)显著抑制急性分离大鼠BSMCs的KV 通道电流 ,该效应被PKC阻断剂Ro3 1 82 2 0显著抑制 ;( 2 )PMA显著抑制体外培养大鼠BSMCs的KV1 5mRNA和蛋白质的表达 ,该效应被Ro3 1 82 2 0显著抑制。上述观察结果提示 ,PKC活化可抑制大鼠BSMCs的KV 通道电流活性 ,下调KV1

转染IκBα基因抑制NF-κB活性对A549细胞侵袭行为的影响

背景与目的:近年来的研究显示核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究探讨抑制NF-κB的活性对A549细胞侵袭能力的影响及其可能的机制。方法:构建表达NF-κB抑制物α同分异构体(inhibitor of NF-κB,α isoform,IκBα)的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/IκBα。体外培养A549细胞,分为未转染组(不转染质粒)、转染pcDNA3.1(+)组、转染pcDNA3.1(+)/IκBα组,分别转染相应的质粒。应用RT-PCR、Westernblot检测各组细胞IκBα的表达情况,应用凝胶电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测各组细胞NF-κB的活性,应用Transwell侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力,应用RT-PCR方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9的mRNA水平,应用明胶酶谱法检测各组细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的活性。结果:酶切鉴定结果显示pcDNA3.1(+)/IκBα质粒构建成功。RT-PCR和Westernblot检测结果表明构建的pcDNA3.1(+)/IκBα质粒能够在A549细胞中表达IκBα。转染pcDNA3.1(+)/IκBα组A549细胞NF-κΒ活性、侵袭细胞数目、MMP-2活性及MMP-9活性均低于未转染组和转染pcDNA3.1(+)组(P值均<0.05),而转染pcDNA3.1(+)组与未转染组之间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论:转染IκBα基因能够抑制A549细胞中NF-κB的活性。NF-κB的活性下降能够抑制A549细胞的侵袭能力,其机制可能与MMP-2、MMP-9表达下调有关。

细胞外信号调节蛋白激酶对哮喘大鼠气道平滑肌细胞周期的影响

目的探讨细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通道调控支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖中的细胞周期机制。方法30只Wistar大鼠随机分为正常组和哮喘组,哮喘组采用卵清蛋白致敏和激发建立哮喘模型。取两组大鼠叶支气管ASMC进行原代培养,采用ERK激动剂表皮生长因子(EGF)和抑制剂PD98059干预哮喘组ASMC。用免疫组织化学法检测ASMC细胞周期蛋白CyclinD1和CDK2的表达;Western免疫印迹检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白的表达,计算ERK活化率。结果哮喘组大鼠ASMC中CyclinD1、CDK2的表达和ERK活化率[76.15±4.88、92.30±7.95和(82.37±5.78)%]均较正常组[54.17±6.11、61.04±4.09和(49.91±3.26)%]显著升高(P均<0.05)。经EGF处理后上述指标进一步升高[119.28±8.14、134.77±9.26和(91.57±5.32)%,P均<0.05],经PD98059处理后显著降低[58.78±4.60、69.15±5.83和(54.01±4.12)%,P均<0.05]。结论哮喘大鼠ASMC增殖活性增强。ERK1/2可通过诱导ASMC中CyclinD1和CDK2蛋白高表达,使细胞从G1期向S期发展,促进细胞增殖。

支气管哮喘模型大鼠气道重建的特征及机制

目的探讨哮喘大鼠气道重建的特征及蛋白激酶C(PKC-α)、核因子κB(NF-κB)在哮喘重建气道中的表达。方法延长卵清蛋白(OVA)激发时间制备慢性哮喘模型。36只Wistar大鼠分为6组:哮喘2、4、8周组和对照2、4、8周组,每组6只。用组织学结合图像分析系统观察各组大鼠气道炎性细胞浸润、胶原面积、平滑肌面积及杯状细胞数目等,免疫组化法观察PKC-α、NF-κB在气道的表达。结果①哮喘2、4、8周组气道壁均可见炎性细胞浸润、黏膜杯状细胞增多,与对照各组同时间点比较差异有显著性意义(P<0.05)。哮喘4、8周组大气道胶原、平滑肌面积增多,与对照4、8周组比较差异有显著性意义(P<0.05)。哮喘各组小气道胶原面积虽有增加,但无统计学意义,但哮喘8周组小气道平滑肌面积增加,与对照8周组比较差异有显著性意义(P<0.05)。②哮喘各组气道上皮细胞PKC-α、NF-κB蛋白表达增加,与对照各组同时间点比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论通过延长OVA激发时间制备大鼠慢性哮喘模型,气道不仅存在慢性炎症,而且气道壁结构有改变,PKC-α、NF-κB可能参与哮喘的气道重建。

川芎嗪对人外周血淋巴细胞蛋白激酶C通道的影响

目的 :探讨川芎嗪 (LTZ)对正常人外周血淋巴细胞 (PBL)蛋白激酶C(PKC)通道在受到与哮喘有关的炎症介质刺激时所发生的功能变化是否有影响。方法 :取 6 3例健康人外周静脉血各 10mL ,分离PBL ,分 4批分别给予以下处理后 ,采用 [γ - 32 P]-ATP催化活性测定法检测细胞胞膜、胞浆及总PKC活性。( 1)分 3组即 5g/LLTZ处理组 ( 6例 )、5 μmol/LPKC阻断剂Ro31- 82 2 0处理组 ( 6例 )和对照组 ( 6例 ,以下各批均以此组为阴性对照组 ) ;( 2 )共 3组分别用 10 0nmol/L乙酰甲胆碱 (Mch ,5例 )、5g/LLTZ +10 0nmol/LMch( 5例 )或 5 μmol/LRo31- 82 2 0 +10 0nmol/LMch( 5例 )处理。 ( 3)共 3组分别采用 10 0nmol/L组胺、5g/LLTZ +10 0nmol/L组胺 ( 5例 )或 5 μmol/LRo31-82 2 0 +10 0nmol/L组胺 ( 5例 )处理。 ( 4)共 3组分别用 10 0nmol/LPMA( 5例 )、5g/LLTZ +10 0nmol/LPMA( 5例 )或 5μmol/LRo31- 82 2 0 +10 0nmol/LPMA( 5例 )。结果 ( 1)LTZ对正常人PBL胞膜、胞浆及总PKC活性均无明显影响 ;( 2 )乙酰甲胆碱及组胺均可促进正常人PBL胞膜PKC活性增加 ,LTZ对该作用有抑制效应 (P <0 0 5 )。 ( 3)LTZ对PMA诱发正常人PBL胞膜PKC活性增加的效应有抑制作用 (P <0 0 5 )。结论

ERK在慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)在慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞的表达,以探讨ERK信号通路在气道平滑肌增殖中的作用。方法:病理图像分析慢性哮喘大鼠气道重塑,免疫组化法检测ERK和PC-NA在肺内表达,激光共聚焦显微镜分析ERK1/2、磷酸化ERK1/2和PCNA在气道平滑肌的共表达,免疫印迹和原位杂交检测气道平滑肌中ERK和PCNA蛋白以及mRNA的表达。结果:慢性哮喘大鼠有气道平滑肌层增厚,出现结构重塑。ERK和PCNA在肺内表达增强,同时在气道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白与mRNA表达增加。结论:ERK可能是介导慢性哮喘气道重建中平滑肌增殖的重要信号通路之一。

丹参注射液对哮喘大鼠气道炎症及CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的影响

目的观察丹参注射液对支气管哮喘(哮喘)大鼠气道炎症和CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Tr)的影响,探讨丹参注射液治疗哮喘的新机制。方法30只Wistar大鼠随机分成正常对照组、哮喘组、丹参治疗组。计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数并分类,应用苏木精-伊红染色行肺组织病理学检查,流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4+CD25+Tr的比例。结果丹参治疗组BALF细胞总数及淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(Eos)百分率较哮喘组均明显减少(P<0.05,P<0.01),与正常对照组比较差异无显著性意义(均P>0.05)。病理组织学显示:丹参治疗组较哮喘组肺组织炎性细胞浸润明显减少。哮喘组PBMCs中CD4+CD25+Tr的比例较正常对照组明显减少(P<0.05),丹参治疗组CD4+CD25+Tr的比例较哮喘组明显增加(P<0.05)。结论丹参注射液可减轻哮喘大鼠气道炎症反应,其机制可能与促进CD4+CD25+Tr的产生有关。

香烟提取物对人支气管平滑肌细胞DNA的损伤作用及细胞应激的影响

目的 :探讨香烟提取物 (CSE)对人支气管平滑肌细胞DNA损伤和细胞应激 (热休克蛋白 70表达 )的影响。方法 :以 1mL培养液中含 30mL烟雾作为原液 ,分别以 1/ 16、1/ 10、1/ 8、1/ 6和 1/ 4浓度与正常人支气管平滑肌细胞培养 3h ,采用单细胞琼脂糖凝胶电泳 (即彗星实验 )和Western印迹技术检测细胞DNA损伤和热休克蛋白 70(HSP70 )的表达。结果 :随着培养液中CSE浓度的增加 ,细胞受损的百分率 (拖尾细胞百分率 )及受损的程度 (尾长 )逐渐增加 ,除 1/ 16原液外 ,其它与阴性对照之间均有显著差异 (P <0 0 5 )。随着培养液中CSE浓度的改变 ,结果发现含 1/ 16和 1/ 10原液的CSE刺激后HSP70的表达有轻度增高的趋势 ,而含 1/ 8原液 - 1/ 4原液的CSE刺激后 ,HSP70的表达逐渐降低。其中含 1/ 6原液组和含 1/ 4原液组与阴性对照组之间HSP70的表达有显著差异 (P <0 0 5 )。结论 :CSE可导致支气管平滑肌细胞DNA的损伤并伴有细胞保护蛋白 (HSP70 )合成的减少 ,可能与慢性阻塞性肺疾病(COPD)

青心酮对慢性阻塞性肺病患者血流动力学及血浆心钠素和环磷酸苷类水平的影响

为了解青心酮对慢性阻塞性肺病（慢阻肺）患者血流动力学的影响，用右心漂浮导管检测了１１例慢阻肺患者应用青心酮前、后血流动力学某些参数，同时采用放射免疫分析法测定了血浆心钠素及环磷酸苷类水平。结果：静脉注射青心酮后，肺动脉平均压及肺循环阻力、体循环阻力均下降（Ｐ＜０．０５）．体动脉压及动脉血气指标无明显变化（Ｐ＞０．０５），心输出量在正常范围内增加。血浆心钠素、环磷酸鸟苷水平下降（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。表明青心酮可能通过调节环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷的比值而达到扩血管目的，其心钠素降低可能是一种继发性反应。

磷酸二酯酶抑制剂对慢性阻塞性肺疾病患者PBMC中IL-08 mRNA表达的影响

目的:探讨磷酸二酯酶(PDE)抑制剂对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-8mRNA表达的影响及机制。方法:采集20例急性发作期COPD患者(A组)和15例正常人(B组)的PBMC。A组的每份PBMC分4组培养:A1组为空白对照,A2组和A3组分别加入100μmol/L及1mmol/L的非选择性PDE抑制剂茶碱,A4组加入选择性PDEⅣ抑制剂Rolipram。应用RT-PCR检测IL-8mRNA的表达,以免疫组化法检测NF-κB阳性细胞的百分率,用Westernblot检测I-κB蛋白的含量。结果:(1)A1组PB-MC中IL-8mRNA的表达及NF-κB阳性细胞的百分率,均显著高于B组;IκB的水平显著低于B组(P<0.01)。(2)与A1组比较,A2组和A3组的PB-MC中IL-8mRNA的表达无显著差异(P>0.05);A4组IL-8mRNA的表达明显下降(P<0.01)。(3)与A1组比较,A2组NFκB阳性细胞的百分率及IκB的水平无显著差异(P>0.05);而A3组的PBMC中NFκB阳性细胞的百分率下降(P<0.05),IκB蛋白的水平无显著变化(P>0.05)。A4组PB-MC中,NF-κB阳性细胞的百分率较A1组明显下降,I-κB蛋白的水平明显增加(P<0.01)。结论:COPD患者PBMC中IL-8mRNA的表达较正常增高,提示IL-8参与了COPD的发病过程;选择性PDEⅣ抑制剂Roli-pram可抑制IL-8基因的表达,其作用机制可能与NF-κB阳性细胞百分率的下降有关。

香烟提出物对被动吸烟大鼠肺泡巨噬细胞源性明胶酶的表达和酶活性的影响

目的:探讨香烟烟雾对被动吸烟大鼠肺泡巨噬细胞源性明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)表达及酶活性的影响。方法:复制被动吸烟大鼠模型,从其支气管肺泡灌洗液(BALF)中分离与培养大鼠肺泡巨噬细胞(AM),经Giemsa染色法鉴定,以台盼蓝染色计数和检测其活性;制备香烟提出物(CSM),刺激培养的AM。以半定量RT-PCR法检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平;以明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9酶活性水平。结果:以0%、1%、3%、5%、10%、15%CSM刺激AM时,MMP-9和β-actin mRNA灰密度值比分别为:0.095±0.006、0.215±0.018、0.468±0.038、0.837±0.047、0.159±0.028、0.092±0.002;而MMP-2和β-actin mRNA灰密度值比分别为:0.109±0.023、0.176±0.036、0.317±0.024、0.370±0.051、0.274±0.025、0.087±0.005。MMP-2酶活性的相对灰密度值分别为6 007.83±147.39、38 202.00±3 160.40、70 532.00±3 225.18、90 074.00±925.62、70 070.17±2 060.33、17 487.67±2 060.33;MMP-9酶活性的相对灰密度值分别为10 904.67±1 697.005、2 627.83±3 974.05、95 284.83±3 098.891、03 400.50±3 441.309、4 650.33±3 825.08、27 571.17±2 129.48。组间均存在显著差异(P<0.05)。结论:香烟烟雾可诱导AM源性MMP-2和MMP-9 mRNA的表达,并导致其酶活性升高;AM及其分泌的明胶酶活性异常可能在吸烟相关的COPD中起重要作用。

香烟提取物对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨香烟提取物(CSE)对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖作用及可能机制。方法:16只SD大鼠随机分为对照组和哮喘组,各8只。原代培养大鼠ASMCs,取第3-6代细胞,分为对照组、对照+CSE组、哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+嘧啶基-苯磺酰胺(GW8510,细胞周期蛋白依赖激酶-4抑制剂)组、哮喘+GW8510组。用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。结果:(1)哮喘组ASMCs与对照组ASMCs相比,在S+G2/M期比例、吸光度(A)值和PCNA表达率上明显增高,差异显著(P<0.01)。(2)哮喘组ASMCsS+G2/M期比例、吸光度(A)值和PCNA表达率分别为(18.30±1.12)%、0.512±0.110、(55.1±3.7)%;哮喘+CSE组分别为(32.12±1.17)%、0.801±0.210、(90.2±7.3)%;哮喘+CSE+GW8510组分别为(17.21±0.95)%、0.508±0.009、(54.3±4.8)%;哮喘+GW8510组分别为(11.16±1.48)%、0.345±0.078、(40.6±5.4)%。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著(P<0.01)。(3)哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+GW8510组、哮喘+GW8510组ASMCscyclinD1mRNAA值比值和蛋白表达A值比值分别为0.236±0.045、0.271±0.002;0.369±0.124、0.379±0.002;0.231±0.075、0.261±0.002;0.165±0.064、0.193±0.002。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著(P<0.01)。结论:正常与哮喘大鼠ASMCs在CSE干预后增殖明显加快,cyclinD1表达明显增加。CSE可能是通过cyclinD1参与调控哮喘大鼠ASMCs的增殖。

脉冲强迫振荡测定值在睡眠呼吸暂停综合征中的变化及其临床意义

目的 观察脉冲强迫振荡 (IOS)测定值在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 (OSAS)患者中的变化 ,并探讨其临床意义。方法 用IOS技术检测 3 6例OSAS患者、14例慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者和 12名正常人呼吸阻抗 ,同时进行睡眠监测。结果 OSAS患者R2 0 明显高于COPD组和对照组 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 1) ,R5～R2 0 虽低于COPD组 ,但仍高于对照组 ,差异亦有非常显著性 (P <0 .0 1)。将OSAS患者睡眠监测指标与IOS测定指标相关性进行研究 ,发现呼吸暂停低通气指数 (AHI)与R5和R2 0 呈正相关 ,相关系数 (r)分别为 0 .66和 0 .86(P <0 .0 1) ;最低SO2 与R5、R5～R2 0 呈负相关 ,r分别为 -0 .66和 -0 .79(P <0 .0 1) ;平均SO2 与R5、R5～R2 0 呈负相关 ,r分别为 -0 .81和 -0 .69(P <0 .0 1)。结论 IOS技术可作为用于检测OSAS患者上气道阻力的一种方法 ,并且有助于其病理机制的探讨。

ERK对慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞凋亡的影响

目的：探讨细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）通路在慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）凋亡中的作用及其机制。方法：30只Wistar大鼠分为正常对照组（A组）和慢性哮喘组（B组），用原位末端标记法和Annexin—V FIT CPI双染色法观察ASMC凋亡，免疫组织化学法检测bcl-2和bax的表达，Western blot检测caspase-3蛋白的表达，并用ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059干预两组ASMC，观察上述指标的变化。结果：与正常对照组ASMC比较，慢性哮喘组ASMC凋亡指数、早期凋亡细胞百分率明显下降。经PD98059干预之后，慢性哮喘组ASMC的凋亡指数与早期凋亡细胞百分率、bax蛋白表达量和caspase-3蛋白含量明显增高，bcl-2蛋白表达量明显降低。经EGF干预之后，慢性哮喘组ASMC凋亡指数与早期凋亡细胞百分率进一步下降，而这一作用可以被PD98059所抑制。结论：慢性哮喘组大鼠ASMC内源性增殖活性增加的同时，伴有凋亡活性下降。ERK1／2参与慢性哮喘ASMC凋亡调控，其机制与bcl-2家族和caspace-3有关。

活性氧和ERK1/2信号通路在缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡中的作用

目的:研究缺氧状态下大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)内活性氧(ROS)水平的变化,ROS对细胞外信号调节激酶(ERK)1/2蛋白表达的影响以及ROS和ERK1/2在PASMCs增殖和凋亡关系失衡中的作用。方法:原代培养正常大鼠PASMCs,选用第2-3代用于实验。分别在常氧及缺氧条件下用ROS清除剂tiron、ERK1/2抑制剂PD98059进行分组干预。通过NBT还原法和DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS,免疫荧光法检测磷酸化-ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达,MTT比色法和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的免疫细胞化学法检测细胞增殖,原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果:(1)缺氧组细胞内ROS水平明显高于对照组(P<0.01);(2)缺氧组的增殖活性与对照组相比显著增高(P<0.01),而凋亡率显著降低(P<0.01),使用tiron后能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖(P<0.05),而凋亡率却明显升高(P<0.01);(3)缺氧组p-ERK1/2蛋白表达显著高于对照组(P<0.01),使用tiron后缺氧诱导的p-ERK1/2表达被显著抑制(P<0.01);(4)使用PD98059也能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖(P<0.05),而凋亡率也明显升高(P<0.01),缺氧下同时使用PD98059和tiron与单用tiron相比,对细胞增殖和凋亡的影响均无明显差异(P>0.05)。结论:缺氧时PASMCs中生成增多的ROS通过活化下游ERK1/2信号通路,促进PASMCs增殖并抑制凋亡,从而在缺氧性肺动脉重建过程中发挥重要作用。

细胞外信号调节激酶1／2信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞迁移功能变化中的调控作用

本研究旨在探讨细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)迁移能力改变中的调控作用。应用卵清蛋白致敏和雾化方法制备大鼠慢性哮喘模型,体外培养大鼠BSMCs,采用免疫荧光细胞化学、Western blot和RT-PCR方法检测ERK1／2信号通路的表达,分别用平面迁移实验和跨膜迁移实验来评价BSMCs的活动和趋向迁移能力,并比较用和不用ERK1／2信号通路干预剂的差异。Western blot结果显示慢性哮喘模型大鼠BSMCs中总ERK1／2(9．13±0．87)较对照组(4．68±0．59)明显增加,磷酸化ERK1／2(p-ERK1/2)占总ERK1／2的比值(0．55±0．05)较对照组(0．48±0．04)显著提高(n=10,P<0．01)。慢性哮喘组ERK1和ERK2 mRNA的表达(1．83±0．24和1．07±0．11)较对照组(0．58±0．14和0．51±0．12)明显增高(n=10,P<0．01)。在平面迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的迁移最远距离是对照组的(2．9±0．1)倍,在ERK1／2激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激下增加到(5．0±0．2)倍,而在30μmol／L PD98059的作用后下降到(1．7±0．2)倍。正常对照大鼠BSMCs平面迁移能力对PD98059的反应较慢性哮喘组弱,仅在100μmol／L PD98059的作用下下降到(0．8±0．1)倍。跨膜迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的跨膜迁移细胞是对照组的(1．9±0．1)倍,在EGF刺激下增加到(3．1±0．2)倍,而在30μmol/L PD98059作用后下降到(1.45±0.2)倍。这些结果表明慢性哮喘模型大鼠BSMCs的迁移能力明显增强,ERK1／2信号通路在该功能变化的调控中可能发挥了重要作用。

周期蛋白D1在蛋白激酶C调控哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察蛋白激酶C(PKC)激活后哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)周期蛋白D1(cyclin D1)的表达变化及两者表达相关性,探讨cyclin D1在PKC调控哮喘大鼠ASMCs增殖中所起的作用。方法:卵清蛋白(OVA)吸入制备SD大鼠2周哮喘模型,原代培养ASMCs。采用正常大鼠(N组)和模型大鼠(A组)第3-6代细胞,分别应用PKC特异性激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)及抑制剂Ro-31-8220干预ASMCs,根据不同处理分为4组:(1)空白组;(2)10nmol/L PMA组;(3)10nmol/L PMA+5μmol/L Ro-31-8220组;(4)5μmol/L Ro-31-8220组。采用流式细胞术,四甲基偶氮唑盐(MTT)法,增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察药物对ASMCs增殖的影响。RT-PCR方法检测PKC-α和cyclin D1 mRNA表达水平,Western blotting方法检测PKC-α和cyclin D1蛋白表达水平。线性相关分析评价PKC-α和cyclin D1表达水平的关系。结果:(1)在哮喘组,与空白对照比较,PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率,差异显著(P<0.01)。在正常组,与空白对照相比,PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率差异均显著(P<0.01)。(2)哮喘组内PMA组、Ro-31-8220组PKC-α以及cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平与空白对照比较,差异显著(P<0.01)。正常组和哮喘组变化趋势一致。(3)在mRNA水平,大鼠ASMCs PKC-α和cyclin D1的表达呈明显正相关(r=0.476,P<0.05),在蛋白水平两者的表达亦呈明显正相关(r=0.899,P<0.01)。结论:PKC-α能促进正常大鼠和哮喘大鼠ASMCs增殖,其在基因和蛋白的表达水平与cyclin D1的表达呈正相关,提示PKC-α可能通过调节cyclin D1而影响ASMCs的增殖。

银杏叶提取物对哮喘大鼠气道炎性细胞蛋白激酶Cα表达及白细胞介素-4分泌的影响

目的探讨银杏叶提取物(EGb)对哮喘的治疗效果及可能机制。方法48只SD大鼠随机分成:正常对照组(6只)、哮喘组(此组再分为:未处理组,激素处理1、2、4周组,EGb处理1、2、4周组,每组各6只)。采用Wright染色法计数肺泡灌洗液中各类炎性细胞的相对数,免疫组化(SP)法测定蛋白激酶Cα(PKCα)的表达情况,ELISA法测定肺泡灌洗液上清中IL-4的含量。结果哮喘未处理组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞(EOS)、淋巴细胞相对计数百分比、PKCα在淋巴细胞和总的细胞中的阳性表达率以及上清液中IL-4含量均显著高于正常对照组(均P<0.05)。与未处理组比较,激素处理不同时间组前述各指标均明显下降(均P<0.05)。EGb处理1、2周组各指标明显高于激素处理组(P<0.05),4周组与激素处理组比较无明显差异。EGb处理1周组除淋巴细胞PKCα阳性表达率外,其余检测指标与哮喘未处理组比较均无明显差异(均P>0.05),而EGb处理2、4周组相关检测指标均明显下降(均P<0.05),且随时间延长,下降更明显(P<0.05)。EGb处理组炎性细胞PKCα阳性表达率与上清液中IL-4、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞的相对计数百分比呈显著正相关(r值分别为0.641、0.699、0.625,均P<0.01,n=18)。结论EGb可减轻气道EOS和淋巴细胞等炎性细胞的浸润以及气道炎性细胞PKCα的阳性表达率和IL-4的分泌量,其作用弱于糖皮质激素,但随着药物治疗时间的延长其药理作用逐渐明显。EGb治疗哮喘的作用可能与其减少炎性细胞PKCα的表达进而降低EOS和淋巴细胞在气道的浸润以及IL-4的浓度有关。