县乡级计划免疫接种率调查的抽样方法

目的：研究县乡级计划免疫接种率调查的抽样方法。方法：在充分利用计划免疫以往信息的基础上，采用整群抽样与二阶段整群抽样方法来实现。结果：建立的方法经计算机模拟与现场验证令人满意。结论：在９５％可信限与±１０％误差条件下，通常对乡级抽取２～３个行政村，对县级抽取６～８个行政村调查，即可反映计划免疫接种率状态。

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的 建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT -PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸。方法 根据GenBank登录的流感毒株序列 ,应用生物学软件进行序列比对 ,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选 ,对荧光定量RT -PCR反应条件进行优化 ,检测该方法的特异性和灵敏度。此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测。结果 该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性 ,对甲1 型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应 ,检测的灵敏度达 0 0 1TCID50 ,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸 ,从病毒核酸提取至完成检测仅需 3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT -PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法。

实时荧光定量PCR技术快速检测麻疹病毒核酸的研究

目的 建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT PCR方法 ,对麻疹病毒的核酸进行检测。方法 对设计的引物与探针进行了筛选与条件优化 ,克服了常规RT PCR定性检测的不足。结果 具有对麻疹病毒检测的高度特异性与准确性 ,检测的敏感度可达 0 1TCID50 ,从病毒核酸提取至检测完成仅需 3个多小时 ,操作简便 ,而且大大减少了常规PCR扩增产物的污染机会。结论 采用该方法对麻疹病毒与相关的临床样本进行了检测 ,均获得了满意的结果 ,为麻疹病毒的分子生物学检测 。

预防接种以乡为单位考核方法的探讨

儿童预防接种率调查．以县及县以上为考核单位时采用ＥＰＩ抽样法，以乡为考核单位时，目前尚无很好的方法。本文采取随机整群抽样法．利用以往资料得出标准差．根据标准差的不同，选择抽样村数，通常在±１０％误差与９５％可信限条件下．抽取乡中２～３个村即可达到考核目的。

对县以下接种率评价的抽样方法探讨

对县以下接种率评价的抽样方法探讨浙江省卫生防疫站（杭州３１０００９）卢亦愚李倩我国已先后实现以省和县为单位儿童免疫接种率达到８５％的目标，采用ＷＨＯ推荐的ＥＰＩ法（９５％可信限，误差±１０％）。在对以乡为单位的接种率调查时，由于范围小，每年出生数少，...

国产风疹减毒活疫苗的免疫程序研究

为了配合国产BRDⅡ风疹减毒活疫苗在我省的推广使用,制订合适的免疫程序,对我省部分地区的人群风疹抗体水平、国产风疹疫苗的免疫效果、麻疹与风疹疫苗的联合免疫等进行研究。当前我省5岁以下儿童风疹抗体阳性率仅19.3%,学龄儿童抗体阳性率60%。经BRDⅡ风疹疫苗免疫后1个月,人群的抗体阳性率平均可达99%,GMRT值为237.5表明,国产风疹疫苗与麻疹疫苗对8月龄儿童联合免疫的阳转率,GMRT值与各自单独免疫时无任何差异。

幽门螺杆菌感染BALB/c无菌小鼠的免疫应答

目的 探讨幽门螺杆菌（ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）感染小鼠的免疫应答状况。方法 建立Ｈｐ 经口感染无菌小鼠的动物模型，设立感染免疫组、感染对照组与免疫对照组３ 组，分别进行试验。结果 感染免疫组抗Ｈｐ 的特异性ＩｇＧ有显著增高（其中以ＩｇＧ１ 为主，ＩｇＧ２ａ 增长较少），且该组小鼠胃中的Ｈｐ 菌数大量减少。结论 此种免疫应答以体液免疫为主，细胞免疫所占比例很少，不能彻底清除小鼠胃中的Ｈｐ。

CD4^+单核细胞中HIV-1 gp120与gp160质粒的构建与表达

采用ｐＳＭＴＥ７作为质粒，进行ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因对ＣＤ４阳性单核细胞Ｕ９３７－２的导入与表达，ｅｎｖ基因导入细胞在微量重金属镉的诱导下，激活启动子表达ｇｐ１２０及ｇｐ１６０，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ转移显色后，可得到清晰的ｅｎｖ目的条带．此外，通过流式细胞仪对表达的ｇｐ１２０与ＣＤ４位点的结合作了分析，验证了该表达蛋白的结构与活性．从实验系可以观察到表达ｇｐ１６０的ＣＤ４细胞株由于表达ｇｐ１６０而引起细胞死亡，而表达ｇｐ１２０的细胞株在表达ｇｐ１２０时不受任何影响．

我国1998～1999年流行的婴幼儿腹泻轮状病毒的分型研究

轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿腹泻的主要病原。根据病毒外壳蛋白VP4和VP7抗原性的不同可区分为不同型 :P(VP4,proteasesensitive)型和G(VP7,glycoprotein)型。 1998～ 1999年在中国 8个城市 (长春、秦皇岛、北京、杭州、福州、广州、成都、昆明 )采集了急性腹泻患儿的 10 93份非细菌性腹泻粪便标本 ,先进行A组轮状病毒(HRV)的筛选 ,其中阳性标本 433份 (39 6 % ) ,电泳型长型占优势 (96 % )。对HRV标本 ,再利用血清型特异的MAbELISA和 /或RT PCR进行G分型。结果表明 ,在 1998～ 1999年 ,在上述 8城市非细菌性腹泻流行季节 ,以HRVG1型为主要流行株 ,占阳性总数的 83 4% ,其次为G3(12 0 % )、G4(3 5 % )和G2 (3 2 % )。此外 ,有 3份(0 7% )HRV标本未能分型 ,12 (2 8% )份标本为混合感染。还结合 1982～ 1996年全国 12个地区 1382份HRV标本的分型资料 ,分析了我国HRVG血清型的流行规律。实验中又抽样选取了 12 4份G型HRV标本 ,用RT -PCR进行P分型 ,其中P[8]型 76份 (6 1 3% ) ,P[4 ]型 14份 (11 3% ) ,P[6 ]型 12份 (9 7% ) ,P[9]型 8份 (6 4% )。另外 15份 (12 1% )未能分出P型 ,有待进一步检定。实验中HRV分离株除了常见的P[8]G1(5 1 4% )、P[4 ]G2(4 6 % )毒株外 ,还检测到P[8]G3(11 0 % )、P[

浙江省登革热暴发疫情的病原学和分子生物学研究

2004年浙江省慈溪市发生了由输入病例引起的登革热暴发,共报告病例113例。为查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,对疑似患者血清测定了登革病毒IgM和IgG抗体,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒。同时采用RT-PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后又分别进行序列测定,并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果表明,从患者血清中检测到登革病毒IgM和IgG抗体及登革I型病毒核酸;从18份疑似患者血清中分离到10株登革I型病毒;浙江登革I型分离株(ZJ/07/04)与登革I型夏威夷株、广东株和泰国株的E基因氨基酸同源性分别为96.3%、98.8%和99.2%,而与登革Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68.3%、77.5%和62.8%。基因进化树显示浙江省登革病毒分离株与泰国株亲缘关系最近,在进化树的同一分支上。从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该次疫情的病因为由泰国输入的登革I型病毒。

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定(TCID50);可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。

Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测甲3型流感病毒

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RTPCR方法用于检测甲3型流感病毒核酸。方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在甲3型流感病毒血凝素(HA)基因的保守区设计引物和TaqMan探针、并进行筛选。对荧光RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度。并对疑似流感含漱液标本进行检测。结果该方法对甲3型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、乙型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR是一种快速检测甲3型流感病毒特异、敏感的新方法。

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。

麻疹病毒抗原性变异及免疫保护效果研究

目的 了解浙江省麻疹野毒株的抗原性变异状况以及麻疹疫苗的免疫保护效果。方法 采用麻疹国际标准株Edmonston株、疫苗株沪191与近几年浙江省分离的麻疹野毒株 (浙 98- 5和浙 0 0 - 4 )分别制备免疫血清 ,与各毒株进行交叉中和试验 ,并分别对不同来源的人群血清测定中和抗体滴度。结果 麻疹野毒株浙 98- 5与疫苗株沪191和Edm株的抗原比分别为 3 0和 2 6 ,浙 0 0 - 4与上述两毒株的抗原比分别为 7 30和 5 6 5 ,其抗原性存在着明显的差异。麻疹疫苗初免儿童和麻疹急性期病人血清对麻疹野毒株的中和抗体几何平均滴度 (GMT)分别为 15 0 3和 5 0 4 ,明显低于疫苗株沪191,GMT分别为 6 8 12和 11 76。但健康人群血清对两毒株的中和抗体滴度无显著性差异。结论 浙江省麻疹野毒株已出现较明显的抗原性变异 ,现行麻疹疫苗的免疫保护效果也受到一定影响。

浙江省一起输入性登革热暴发的流行病学调查分析

目的分析浙江省2004年一起输入性登革热暴发的流行病学特征,为制订登革热预防控制措施提供科学依据。方法确定病例定义进行回顾性病例搜索和流行病学调查。采用间接免疫荧光法对疑似病例血清进行登革热抗体检测,用C6/36细胞对急性期病人血清进行病毒分离,以荧光定量RT-PCR方法鉴定。用布雷图指数(BI)法进行蚊蚴密度调查。结果本次疫情流行历时85d,共发病83例,登革热抗体阳性68例,并分离到登革Ⅰ型病毒8株。病例主要集中在某镇的城镇所在地。男性29例,女性54例,发病年龄最小7岁,最大76岁,以20～60岁占78.31%。疫情发生时疫区布雷图指数高达326。经采取以快速杀灭成蚊和清除伊蚊孳生地为主的综合防治措施后,疫情很快得到控制,发现疫情10d后未再出现新发病例。结论本次疫情是由登革Ⅰ型病毒引起。媒介伊蚊大量繁殖,传染源输入是引起此次登革热流行的主要因素。早期病例被误诊,传染源未被及时发现是导致疾病传播的重要原因。迅速灭蚊和消除伊蚊孳生地是控制疫情的有效措施。有必要加强输入病例监测和蚊媒控制工作。