柯萨奇病毒B3蛋白酶2A干扰核因子κB p65的二聚体形成和核转移

为探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)蛋白酶2A是否通过干扰核因子κB(NF-κB)的核定位而影响细胞因子表达,构建CVB3蛋白酶2A的表达载体pcDNA3.1-2A。将此表达载体与核转录因子NF-κB基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NF-κB promotor-Luc共转染细胞,经肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激,检测荧光素酶表达;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹检测CVB3蛋白酶2A对NF-κB核定位和二聚体形成的影响。结果显示,CVB3蛋白酶2A可减少NF-κB二聚体形成,并干扰其核转移。本研究证实,CVB3蛋白酶2A可通过干扰NF-κB二聚体形成和核转移而影响细胞因子分泌。

食品微生物检验内容

食源性病原微生物是通过污染食品,进而导致人类患病的微生物.食品安全检测是食品安全管理的基础,近年来食品安全问题经常发生,而食品中病原微生物引发的疾病占了很大比例：美国曾发生菠菜、点心、紫花苜蓿芽、西红柿、花生酱、鸡蛋等污染沙门氏菌引起的食品召回或爆发事件;2011年德国大肠杆菌疫情爆发引起全球性的恐慌;日本多次发生牛肉、牛奶等食品中污染金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等致病微生物的事件.提高致病微生物的检测水平是提升食品安全水平的一项不可少的措施,目前食品微生物主要检测内容如下所述.

CVB32A蛋白酶抑制帽样结构依赖的蛋白翻译

目的探讨CVB3的蛋白酶2A对真核细胞帽样蛋白翻译和内部核糖体进入位点（IRES）翻译机制的影响。方法构建表达载体pcDNA3．1—2A，将此表达载体分别与pEGFP—N1、pGL3（F-luc）以及pIRES-GFP载体共转染细胞后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，检测荧光素酶蛋白的表达。WesternBlot检测CVB3病毒和pcDNA3．1-2A对真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）及多聚A尾结合蛋白（PABP）的影响。结果pcDNA3．1之A可以减少帽样依赖的GFP和荧光素酶蛋白的表达，但可以促进IRES依赖的GFP表达。CVB32A基因质粒转染和CVB3感染后，均可发现细胞内elF4G的切割现象；同时CVB3对PABP也有降解作用，而CVB32A基因转染对PABP无明显作用。结论CVB3的蛋白酶2A抑制真核细胞帽样途径蛋白翻译，促进IRES途径的翻译。

EMCV3C蛋白酶抑制真核细胞蛋白质合成的研究

目的 探讨脑心肌炎病毒（EMCV）的3C蛋白酶对真核细胞转录及翻译机制的影响.方法 构建真核表达载体pcDNA3.1-3C,将表达载体分别与帽样依赖的绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP-N1和萤火虫荧光素酶（Fluc）载体pGL3载体共转染细胞后,检测GFP和Fluc的表达.Western Blot检测EMCV病毒和pcDNA3.1-3C对真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）及多聚A尾结合蛋白（PABP）的影响.RT-PCR检测pcDNA3.1-3C对GFP mRNA转录水平的影响.结果 EMCV-3C可以抑制帽样依赖的GFP和Fluc的表达.EMCV 3C和EMCV病毒感染均导致细胞内PABP发生切割,而对eIF4GI均无明显作用.EMCV-3C也可导致GFP基因mRNA转录水平下降.结论 EMCV的蛋白酶3C通过mRNA转录水平的抑制和PABP的切割而抑制真核细胞帽样结构依赖途径的蛋白翻译,从而抑制蛋白质的合成.

脑心肌炎病毒（EMCV）3C真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的EMCV的pEGFP-3C真核表达载体的构建及功能鉴定。方法RT—PCR扩增EMCV功能蛋白3c基因并克隆至pEGFP—C3载体中，经双酶切和测序鉴定。将重组质粒分别转染到BHK-21细胞和293T细胞48h后，Western—Blot检测3c蛋白酶的表达，以及对PABPl的切割，共聚焦显微镜观测3c荧光表达位置。结果EMCV的pEGFP-3C重组质粒经双酶切及测序鉴定构建正确。表达的GFP融合蛋白相对分子质量约为49×10^（3），可切割PABPl，并表达于细胞核内。结论成功构建了EMCV的3c蛋白酶的真核表达载体pEGFP-3C，为进一步研究该蛋白酶的功能及作用奠定了基础。

EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

为了解EV71病毒对细胞核转运机制的影响,本研究构建了具有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体(pG-FP-NLS)。将此表达载体转染细胞后,使用EV71病毒感染转染细胞,结果发现EV71病毒可以有效阻止绿色荧光蛋白的核转移。将EV71病毒的2A蛋白酶真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞,可以发现2A蛋白酶可阻止具有核定位信号的绿色荧光蛋白的核转移而使绿色荧光蛋白表达于细胞浆。为了进一步研究病毒阻止核转移的机制,病毒感染细胞或通过转染2A蛋白酶真核表达载体进行Nup62的Western blotting检测,结果显示病毒以及2A蛋白酶均可引起Nup62表达下降。证明EV71可通过2A蛋白酶切割Nup62从而抑制核转运。

浅谈实验室标准菌株的管理

本文从标准菌株的管理目的、适用范围、人员或科室职责和管理程序四个方面详细的探讨了实验室标准菌株的管理,为各实验室标准菌株管理者提供了参考和借鉴。