鲑鳟鱼病毒性疫病现场快速检测发展现状与展望

鲑鳟鱼是鲑科家族所有鱼类的总称,是典型的冷水性鱼类,具有很高的营养价值和经济价值[1]。联合国粮食及农业组织在2022年水产养殖的报告中指出,近几十年来,鲑科鱼特别是养殖的大西洋鲑(Salmo salar)一直是全球渔业和水产养殖产品贸易增长的主要贡献者之一[2]。中国养殖鲑鳟鱼类已有50余年的历史,有大西洋鲑、白点鲑(Salvelinus leucomaenis)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、哲罗鲑(Hucho taimen)等10余个养殖品种[1]。据统计,2022年我国鲑鳟鱼养殖总产量约4.03万t[3]。随着我国水产养殖规模的逐渐扩大和相关产业及贸易的发展,水生动物疫病带来的风险和负面影响也愈发显著。2021年,我国水产养殖因病害造成的经济损失约为539亿元[4]。水产养殖病害也成为现阶段威胁我国鲑鳟鱼产业发展的重要因素。

免疫磁珠富集水中鲤春病毒血症病毒的初步研究

为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术对水中SVCV进行检测。结果显示,1 mg磁珠与75μg SVCV多克隆抗体耦联时,耦联的抗体量最大,耦联率为98.48%;耦联后的免疫磁珠对SVCV(200μL,浓度为1.54×10^(6)拷贝/μL)的富集效率最高为91.56%。以该多克隆抗体量制备的免疫磁珠富集10倍倍比稀释的SVCV(3.54×10^(6)拷贝/μL~3.54×10^(3)拷贝/μL),以确定其有效富集SVCV的最低浓度。结果显示,1 mg免疫磁珠能够使200μL病毒液(3.54×10^(3)拷贝/μL)富集率达到61.58%。表明该免疫磁珠能够有效富集SVCV。在免疫磁珠分离技术联合RT-qPCR技术检测水样品中SVCV(浓度约为1.16×10^(4)拷贝/μL)的结果显示,免疫磁珠组富集SVCV核酸量是裸磁珠组富集SVCV核酸量的1.77×10^(3)倍,是未处理组富集SVCV核酸量的1.68×10^(3)倍,免疫磁珠组富集SVCV均极显著高于裸磁珠组和未处理组(P<0.01),裸磁珠组富集的SVCV与未处理组则无显著差异(P>0.05)。本研究首次建立了一种能够有效富集水中SVCV的方法,为SVCV的监测提供了技术手段。

猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明:建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10~2~0.5×10~6 copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

施马伦贝格病诊断技术研究概况

施马伦贝格病(Schmallenbergdisease,SBD)是由施马伦贝格病毒(Schmallenbergvirus,SBV)引起的反刍动物虫媒传染病,目前对其尚无有效治疗手段,及时检测病原和抗体对其进行确诊,是其防控的重要举措。SBD诊断技术主要包括,病原学检测的病毒分离与鉴定、RT-PCR、实时荧光RT-RAA,血清学检测的病毒中和试验(VNT)、蚀斑减少中和试验(PRNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条。每种检测方法各有优势和不足,其中病毒分离与鉴定和VNT是经典的SBD确诊方法,但因其涉及病毒培养,操作严格,耗时长;RT-PCR和ELISA方法操作简单,是常用的SBV实验室检测方法;实时荧光RT-RAA和免疫层析试纸条检测反应时间短,适用于SBV的现场快速筛查。因此在实际应用时,可根据自身要求和目的,结合实际情况选择一种或多种检测方法进行SBD诊断。本文主要总结了近年来有关SBD的病原学和血清学诊断技术研究进展,以期为SBD监测和防控提供技术参考。

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG_(1)/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10^(5)。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和常数(Ka)为9.68×10^(8)L/mol。初步建立的阻断ELISA试验显示,36A3能够有效区分阴阳性血清,N/P高达12.53,提示其为非常有效的阻断ELISA候选抗体。本试验结果为深入研究非洲猪瘟病毒CD2v蛋白功能及研发非洲猪瘟病毒阻断ELISA血清学检测试剂盒奠定了基础。

诺如病毒的流行、诊断与防控建议

诺如病毒是一种重要的人畜共患病毒,也是一种重要的食源性疾病病毒,该病毒可以通过肉、乳、鱼、贝类等多种生鲜动物及其制品的携带而传播,短时间内即可引起聚集群体的集体发病,发生呕吐、腹泻等急性肠胃炎症状,严重时还会给人类生命带来重大威胁。由于其危害多种动物及其制品的质量安全,且每年在世界范围内频繁发生,因此,加强市场上活动物及动物制品的检验检疫,在市场流通环节对疫病进行把控,做好市场生物安全监管工作,提高对该病的正确认识与精准检验检测,能够有效改善我国动物及其产品的质量安全,维护我国人民身体健康。

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究将含有非洲猪瘟病毒p72全长基因序列的pCMV-p72重组质粒与B602L质粒共同转染HEK293F细胞,纯化获得重组p72-His蛋白,经SDS-PAGE和间接ELISA鉴定后,以该纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,进行融合、筛选获得4株单克隆抗体。经亚型鉴定,2B2-1、34C10和22D3均为IgG1/κ型,32H5为IgG2b/κ型,4株单克隆抗体的腹水效价均高于6.4×104。免疫荧光检测结果显示4株单克隆抗体均能够特异性识别ASFV p72蛋白,亲和力试验显示4株单克隆抗体的亲和力由高到低依次为22D3>32H5>2B2-1=34C10,表位竞争试验也揭示这4株单克隆抗体可识别不同的抗原结合位点,且2B2-1和32H5能组成识别抗原的抗体对,34C10单克隆抗体具有竞争效应。所获得的4株杂交瘤细胞株均能够稳定分泌抗体,且分泌的抗体特异性高,亲和力强,有助于进一步研发ASFV血清学诊断方法。

鱼类细胞系研究现状

鱼类细胞系是研究鱼类病毒学、生理学、毒理学、免疫学和分子遗传学的重要材料和重要的体外研究系统。鱼类细胞系的组织来源包括脑、心脏、鳃、肾脏、鳍条和卵巢等各种组织。目前已至少建立并应用了826株鱼类细胞系。本文综述了近年来鱼类细胞系的组织来源、培养方法及应用现状,旨在为鱼类细胞系研究提供最新的数据支撑。

猪制品中非洲猪瘟病毒核酸提取方法的比较

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。结果显示:猪制品模拟感染样品中,ASFV核酸在上清和沉淀中均被检出,且上清中的检出量高于沉淀;对于香肠模拟感染样品上清,3种核酸提取方法均适合,但以柱式提取方法为佳,病毒回收率高达82.8%;对于新鲜猪肉模拟感染样品上清,以磁珠吸附核酸提取方法为佳,病毒回收率为20.9%;对于血粉模拟感染样品上清,以柱式核酸提取方法为佳,病毒回收率为10.2%。本研究为不同猪制品中ASFV核酸提取提供了参考。

猪瘟病毒装甲RNA颗粒质控品的研制及评估

[目的]研制一种安全稳定高效的猪瘟核酸检测质控品,为猪瘟疫病监测提供技术支持。[方法]将猪瘟病毒核酸检测靶基因构入至新型装甲RNA表达载体pTMACC,转化、表达并纯化,制备猪瘟病毒装甲RNA质控品。借助电泳、电镜、动态散射分析鉴定该物质结构特性,并对其均匀性、稳定性进行分析,评估其实用性能。[结果]该装甲RNA颗粒含有猪瘟病毒特异性基因,序列溯源至法国Thiverval株;为RNA-蛋白复合物,颗粒呈直径约26 nm的多边形;该质控品均匀、稳定,-20℃至少稳定保存36个月;经8家权威实验室性能评估,该物质可以作为猪瘟病毒核酸检测质控品。[结论]猪瘟病毒装甲RNA质控品均匀性良好,稳定性强,无生物传染性,核酸RNA不易降解,可稳定保存,进一步保障猪瘟疫病的临床检测的准确性。

2018-2022年鲫造血器官坏死病病原检测能力验证结果分析

通过开展鲫造血器官坏死病(CHN)病原检测能力验证,不断提高中国鲫造血器官坏死病病原检测的整体水平,加强相关实验室鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)检测能力,2018—2022年期间开展了5次该能力验证项目。能力验证样品经均匀性和稳定性检验后,随机组合成每组4份样品发放。依据GB/T 36194—2018《金鱼造血器官坏死病毒检测方法》中推荐的聚合酶链式反应(PCR)方法进行检测,并对各参加单位提交的检测结果进行评价。2018—2022年全国共有411家/次实验室参加,测试结果满意率依次为86.57%、83.10%、86.50%、87.74%和85.86%。能力验证统计结果表明,大部分实验室具备了鲫造血器官坏死病病原检测能力和质量管理水平,可以承担该病原的检测和监测工作,为鲫造血器官坏死病监测预警提供了有力支撑。

猪巨噬细胞培养模型的建立与应用

本研究建立了猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)的体外细胞培养模型,并利用该模型进行了病毒及遗传学操作等方面的初步应用。分离猪肺泡巨噬细胞后,利用多种培养条件进行培养和观察,通过光学显微镜对培养后的PAM进行形态学观察,并利用脂多糖诱导其分化,检测分泌细胞因子的能力,建立PAM细胞体外培养模型。为进一步验证PAM细胞模型的功能,利用对表达红色荧光蛋白的大肠埃希菌(E.coli)检测PAM的吞噬功能;利用Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)疫苗毒鉴定其扩繁病毒的能力;利用体外包装的慢病毒对PAM细胞进行基因操作,并对慢病毒感染前后病毒的吞噬功能进行研究。结果显示,本研究建立PAM细胞培养模型,细胞生长状态良好且对E.coli有强的吞噬能力;病毒感染实验显示,诱导产生的猪PAM细胞能有效的扩繁PRRSV疫苗毒;体外包装的慢病毒也能感染本研究的细胞模型,且感染后PAM细胞仍然对细菌具备吞噬功能。本研究成功建立了PAM细胞体外培养模型,为研究PAM细胞的免疫分化功能、病毒的感染免疫细胞的免疫机制等提供了坚实的研究基础。

反刍动物埃立克体微滴数字PCR方法的建立及初步应用

为建立反刍动物埃立克体(E.ruminantium)准确定量的微滴数字PCR方法(ddPCR),本研究以E.rum-inantium pCS20基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,建立了E.ruminantium ddPCR方法。利用本研究建立的ddPCR方法检测E.ruminantium、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、无形体、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体等,结果显示仅E.ruminantium出现特异性扩增,而与其他寄生虫均无交叉反应,特异性强;将pUC57-pCS20重组质粒标准品10倍倍比稀释(1×10^(-1)拷贝/μL~1×10^(5)拷贝/μL)后,利用该ddPCR方法检测,结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.8拷贝/μL,比相应荧光定量PCR方法的敏感性高10倍,本实验建立的ddPCR方法敏感性高;批内和批间重复性试验结果变异系数(CV)均小于2%,重复性好。利用建立的ddPCR方法对50只钝眼蜱样品检测,结果显示,阳性样品反刍动物埃立克体核酸的最低拷贝数为26拷贝/μL,ddPCR和荧光定量PCR检测试剂盒的检出率均为16.0%(8/50)。本研究首次建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为E.ruminantium准确定量检测的有效手段。

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线(T)和质控线(C)。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。

猫传染性腹膜炎诊断方法研究进展

猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis,FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的全身性、致死性疾病。近年来,FIP在世界各地广泛流行,感染率呈上升趋势。文章对FIP的诊断方法进行了全面总结,以期为FIP的临床和实验室诊断提供参考和指导。

重组酶聚合酶扩增核酸试纸条快速检测诺如病毒方法的建立与应用

旨在建立快速检测GⅠ型诺如病毒的方法与快速检测GⅡ型诺如病毒的方法。分别以GⅠ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅠ-F、Nov-GⅠ-R与探针Nov-GⅠ-probe、以GⅡ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅡ-F、Nov-GⅡ-R与探针Nov-GⅡ-probe,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过核酸检测试纸条对扩增产物进行分析鉴定。通过检测不同拷贝数的重组GⅠ型NoV阳性质粒对GⅠ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,通过检测不同拷贝数的重组GⅡ型NoV阳性质粒对GⅡ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,并与普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行比较;以星状病毒、MS2噬菌体基因组、人轮状病毒和人腺病毒重组质粒作为模板对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法的特异性进行评价;应用建立的两种方法对市场上采集的20份食品样品进行GⅠ型NoV检测与GⅡ型NoV检测。GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法检测到最低质粒拷贝数均为101 copies/μL,且两种检测方法对其余病毒均具有良好特异性;对于从市场采集的潜在携带NoV的食品样品进行检测,结果均为阴性。本研究建立的针对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法相较于普通PCR与实时荧光PCR具有检测时间短、特异性强、灵敏度高以及检测操作简单快捷的优点,更适用于市场流通领域食品及医学检测等现场快速检测的应用。

施马伦贝格病毒N蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的双抗体夹心ELISA方法,本研究利用原核表达系统纯化SBV N蛋白,并免疫小鼠制备抗SBV N蛋白单克隆抗体(mAb)。以制备的mAb 4D6作为捕获抗体,HRP标记的mAb 5D3经作为检测抗体,经条件优化,建立了基于SBV N蛋白的双单抗夹心ELISA检测方法。结果显示,捕获抗体和检测抗体的稀释度分别为1∶160000和1∶80000,重组SBV N蛋白浓度在3.9~125 ng/mL范围与OD450nm值呈现良好的线性关系,标准曲线为y=0.0224x+0.3896,R^(2)=0.9715。此方法检测下限为3.9 ng/mL,显示较高的敏感性。该方法检测AKAV、BTV和BVDV均为阴性,具有良好的特异性。因此,本研究建立的双单抗夹心ELISA方法为SBV快速诊断和N蛋白功能研究提供技术支撑。