载5-氟尿嘧啶两亲多糖纳米粒的制备及其对肝癌细胞HepG2的杀伤作用

背景与目的:生物可降解载药纳米微粒作为新型药物靶向传输和缓释/控释载体,可延长药物的生物半衰期,减轻药物的毒副作用,而且具有良好的生物相容性。本实验制备可生物降解的载5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)葡聚糖接枝聚乳酸共聚物(5-FU/DEX-g-PLA),探讨其对人肝癌细胞HepG2的体内外杀伤作用。方法:利用分子自组装技术制备5-FU/DEX-g-PLA载药纳米微粒,透射电镜观察纳米粒形态,分光光度法计算载药率,MTT法观察对HepG2细胞的体外杀伤作用,动物实验观察其体内抑瘤效应。结果:5-FU/DEX-g-PLA纳米微粒呈球形,粒径约50nm,药物包封率约9.3%。体内药物代谢动力学数据显示,5-FU纳米制剂在血液中维持时间长于5-FU裸药;MTT结果显示,5-FU纳米组细胞生长抑制率(58.8%)与5-FU裸药组(58.0%)差异无显著性(P>0.05);体内抑瘤实验显示,5-FU纳米组肿瘤抑制率(73.1%)显著高于5-FU裸药组(57.5%)。结论:5-FU/DEX-g-PLA纳米微粒可有效抑制肝癌细胞的生长。

两亲多糖纳米胶束作为药物缓释载体的制备及释药研究

【目的】合成葡聚糖接枝聚乳酸(DEX-g-PLA)两亲多糖共聚物,检测其纳米胶束的相关参数,初步探讨其纳米胶束在药物缓释方面的应用。【方法】采用偶联法合成DEX-g-PLA。用透射电子显微镜观察所形成胶束的形态;用动态光散射仪观察纳米胶束有效粒径的变化。体外药物释放实验考察其对不同水溶性药物的缓释作用。MTT法考察其生物相容性。【结果】DEX-g-PLA纳米胶束,呈球形,粒径在50～190nm之间,其有效粒径随聚乳酸含量的增加而增大。载药纳米胶束对疏水性维生素B2的缓释效果优于亲水性的5-氟尿嘧啶。MTT结果显示该纳米胶束具有良好的生物相容性。【结论】DEX-g-PLA纳米胶束具有良好的生物相容性,对疏水性药物的缓释作用优于亲水性药物,有望成为新型药物缓释载体。

RNAi抑制NANOG表达对肝癌细胞HepG2中MDR1表达及阿霉素敏感性的影响

目的探讨抑制NANOG表达对肝癌细胞HepG2中多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)表达及阿霉素敏感性的影响。方法将靶向NANOG基因的特异性siRNA转染肝癌细胞HepG2,Real-time PCR和Western blot检测siRNA沉默NANOG基因后NANOG、MDR1 mRNA和蛋白的表达,平板克隆形成实验检测沉默NANOG基因后对细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测沉默NANOG基因后对细胞周期的影响,CCK-8法检测沉默NANOG基因后HepG2细胞对阿霉素的敏感性情况。结果靶向NANOG基因特异性siRNA转染肝癌细胞HepG2后,能有效抑制NANOG mRNA和蛋白表达,与Mock组比值分别为(0.32±0.05)和(0.38±0.08);与Mock组比较,沉默NANOG基因后,细胞克隆形成率下降[(8.51±3.63)%vs(17.13±2.24)%,P<0.05],进入G0/G1期的细胞比例增多[(75.33±8.21)%vs(57.81±5.05)%,P<0.05],HepG2细胞对阿霉素的敏感性增强(P<0.05),HepG2细胞内MDR1 mRNA和蛋白表达下降,与Mock组比值分别为(0.35±0.06)和(0.41±0.08)。结论抑制NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中MDR1的表达下调并增强细胞对阿霉素的敏感性。

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1mRNA和蛋白水平均下调(P<0.05),细胞增殖能力下降(P<0.05),进入G0/G1期的细胞比例增多(P<0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。

NANOG基因在侧群表型干细胞样肝癌细胞中的表达及意义

【目的】基于侧群(SP)细胞分选方法,从肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选SP表型干细胞样肝癌细胞,观察干细胞标记物NANOG基因在该SP表型肝癌细胞中的表达。【方法】采用流式细胞术检测和分选肝癌细胞Huh7和Hep3B中的SP细胞和非侧群(NSP)细胞,细胞生长曲线法检测SP和NSP细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测SP和NSP细胞的侵袭能力,MTT法检测SP和NSP细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(DOX)的药物敏感性;Real-time PCR和WB检测SP与NSP细胞中NANOG基因的表达。【结果】肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选的SP细胞比例分别为(5.3±0.8)%和(13.49±1.0)%。生长曲线表明Huh7和Hep3B的SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P<0.05),体外侵袭实验结果显示Huh7和Hep3B的SP细胞体外侵袭能力高于NSP细胞(P<0.05),MTT结果显示Huh7和Hep3B SP细胞对5-FU和DOX有耐药性,高于NSP细胞(P<0.05)。Huh7和Hep3B SP细胞NANOG mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的4.17和5.51倍(P<0.05),NANOG蛋白平均表达水平分别是NSP细胞的3.78和5.01倍(P<0.05)。【结论】肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选的SP细胞符合肿瘤干细胞的部分生物学特征,NANOG基因在SP表型干细胞样肝癌细胞中高表达。

小儿腹腔镜阑尾切除与开腹阑尾切除的临床对比研究

目的 对比研究小儿腹腔镜阑尾切除术（LA）与传统开腹阑尾切除术（OA）的临床疗效及安全性.方法 回顾性分析2009年1月～2012年12月期间进行LA和OA的93例小儿阑尾炎患者的临床资料,对两组手术时间、术中出血情况、术后恢复情况等进行统计对比分析.结果 两组患儿手术及恢复顺利,术后无严重并发症.两组手术时间及术中出血量差异均无统计学意义（P＞0.05）;LA组术后肛门排气时间、下床活动时间、切口疼痛时间、术后住院天数均低于OA组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 与OA比较,小儿LA具有创伤小、并发症少,恢复快及美容等优势,是治疗小儿阑尾炎理想的手术方式.

经肛门I期先天性巨结肠根治术临床观察

目的探讨经肛门I期先天性巨结肠根治术的治疗方法和临床效果。方法对12例已证实为短段型或普通型先天性巨结肠患儿行经肛门I期先天性巨结肠根治术。年龄3月至5岁,平均1.8岁。结果全组手术顺利,无死亡。术后1周左右出院,随访半年,术后有1例出现轻度排便困难,经保守治疗痊愈。有3例出现不同程度的污粪,3～6月后痊愈。无严重并发症,生长发育良好。结论经肛门I期巨结肠根治术适用于患短段型或普通型先天性巨结肠症的婴幼儿,手术创伤小,不需开腹,合并症少、手术时间短,效果满意。

热诱导调控序列的合成及其热诱导特性的研究

目的探讨合成热诱导性的HSP70启动子调控序列,并鉴定加热条件下诱导其下游报告基因表达的特性。方法利用PCR方法,以肝癌细胞株HepG2基因组为模板,体外合成热休克蛋白70(HSP70)启动子序列。利用双酶切法构建HSP70启动子调控的含EGFP报告基因的真核表达载体pcDNA-HSP70-EGFP。以脂质体为载体,体外转染肝癌细胞株HepG2,在不同的温度下(37℃、39℃、41℃、43℃、45℃)加热不同时间(0、15、30、45、60min)后,利用流式细胞术检测报告基因EGFP表达强度,从而判定温度及时间对HSP70启动子热诱导活性的影响。结果合成的HSP70启动子序列测序结果与GeneBank中AL671762所提供序列完全一致。低温加热后EGFP在HepG2细胞中的表达强度不同程度增强,在43℃/30min时最为明显,为未加热组的3.3倍。结论成功合成可热诱导的HSP70启动子序列;HSP70启动子在低温加热下能明显增强其下游外源基因的表达,为进一步研究肿瘤热疗-基因治疗提供了实验基础。

小儿全身麻醉苏醒期躁动的危险因素分析

【目的】探讨小儿手术患者全身麻醉苏醒期躁动的危险因素。【方法】选择小儿全身麻醉患者410例,按照镇静躁动分级法对其苏醒状况进行评分,排除4分以下的患儿,对余下165例患儿的相关病史及麻醉病历分别作单因素和多因素logistic回归分析,评价小儿全身麻醉苏醒期躁动相关危险因素。【结果】单因素分析发现:手术史、手术大小、术后疼痛、麻醉维持方式、右美托咪啶、氯胺酮、曲马多、术后镇痛与躁动的发生相关(P<0.05)。多因素分析发现:年龄、术前焦虑、手术大小、术后疼痛、麻醉维持方式、右美托咪啶、留置尿管、术后镇痛等与躁动发生相关(P<0.05)。性别、性格、留置胃管、中心静脉置管、手术时间、拮抗、吸痰和腹腔镜手术与躁动发生无关(P>0.05)。【结论】小儿麻醉患者中学龄前儿童、术前焦虑、中等以上手术、全凭七氟醚吸入麻醉维持、留置尿管及术后疼痛患儿的术后躁动发生率显著增高。

MAGE-3多肽纳米疫苗对小鼠胃癌种植瘤抑瘤效应研究

背景与目的:纳米颗粒作为疫苗载体可保护抗原免受酶解,增强免疫原性,是一类极具开发潜力的新型疫苗载体。本实验制备负载CD4+CD8+T细胞表位MAGE-3多肽抗原的纳米疫苗,探讨其相关特性及抗肿瘤免疫。方法:利用自组装技术制备多肽/Chit-DC(壳聚糖-脱氧胆酸)载药纳米胶束,透射电镜观察纳米微观形态,荧光分光光度法计算负载率、载药量,并测定药物释放规律。流式细胞仪检测DC(树突状细胞)对药物的吞噬率,酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和细胞毒性实验检测MAGE-3多肽纳米疫苗激活机体细胞免疫反应的状况。动物实验观察其体内抑瘤效应。结果:成功制备多肽/Chit-DC纳米胶束,药物包封率约为37%,载药量为17%。载药纳米颗粒中的多肽在pH7.4的PBS中释放缓慢,于48h达释放平台;在2mg/mL溶菌酶溶液中,药物有一定的突释现象,于24h达释放平台。ELISPOT和细胞毒性实验显示MAGE-3多肽纳米疫苗可以激活体内免疫反应而产生针对MAGE-3的CTL,特异性杀伤表达MAGE-3的肿瘤细胞。体内抑瘤实验显示,多肽纳米疫苗组相对肿瘤抑制率为37.81%。结论:MAGE-3多肽/Chit-DC纳米疫苗能有效激活体内的抗肿瘤免疫效应,抑制MFC小鼠前胃癌细胞的生长。

改良腹腔镜Swenson与Soave术对儿童短段型先天性巨结肠疗效差异

目的对腹腔镜Soave术(LS)和改良腹腔镜Swenson术(MLSw)在儿童短段型巨结肠的治疗效果和并发症进行比较分析。方法回顾分析我科自2007年3月至2016年12月收治的77例儿童短段型巨结肠临床资料。LS术26例,MLSw术51例。收集两组术前、术中和术后临床资料进行分析,随访12~48个月。结果 MLSw组平均手术时间、术中出血量和住院时间比LS组少。两组术后平均进食时间无明显差异。MLSw组术后早期并发症的发生率较LS组低,但两组术后晚期并发症发生率无明显差异。结论 LS和MLSw术都适用于儿童短段型巨结肠的治疗。但MLSw操作更简单,术后早期的排便控制更好。更重要的是,MLSw术可完全切除无神经节细胞肠段,而无需保留直肠肌鞘。

重组pDC316-MCMV/hNIS真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞的功能

【目的】克隆人的钠/碘同向转运体(hNIS)基因可编码序列,并研究其在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达。【方法】利用逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)从毒性弥漫性甲状腺肿(又称Graves病)病人的甲状腺组织中扩增得到NIS的可编码区基因,并克隆到T载体,测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pDC316载体上,获得重组真核表达质粒载体pDC316-MCMV/hNIS。采用脂质体转染的方法,把pDC316-MCMV/hNIS重组质粒(实验组)或pDC316空质粒(对照组)分别导入到胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞,转染后48h采用RT-PCR方法检测转染细胞内的hNIS mRNA水平,转染后第2、3、4天分别检测肿瘤细胞对125I的吸收功能。【结果】序列分析结果证实克隆片段与文献报道的hNIS基因cDNA序列完全一致。实验组转染后48h,在CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检测到hNIS mRNA高水平表达,对照组基本无hNIS mRNA表达。转染后第3天细胞吸碘达到高峰,实验组CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和SK-OV-3细胞对125I的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍。【结论】从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后,能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能,为进一步运用放射性核素体内靶向治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础。

应用淤胆血清“病理微环境”从ESC中筛选肝干细胞的研究

目的:探讨淤胆血清"病理微环境"培养体系诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的效果及对肝干细胞的筛选作用。方法:将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养,使其自发分化为拟胚体,加入FGF-4和HGF初步诱导,然后置于5%淤胆鼠血清"病理微环境"筛选培养液中继续培养2周,然后进行细胞形态学观察,ALB和CK8/18免疫荧光染色,电镜检查和吲哚氰绿(ICG)摄取试验。结果:经初步诱导分化的ESC置于5%淤胆血清"病理微环境"筛选培养液中培养,初期细胞生长受抑制,部分细胞坏死、凋亡并脱落。1周左右可见上皮样细胞集落呈优势生长。2周左右可见较多肝细胞样集落形成单位(H-CFU),大部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞,呈现较好的均质性,从中央到周边呈逐渐分化成熟的趋势;免疫荧光染色显示ALB和CK8/18表达;电镜检查可见与肝细胞相似的超微结构;吲哚氰绿(ICG)摄取试验可见大量ICG阳性细胞,提示这些细胞具备部分肝细胞特性,且筛选诱导组ICG阳性率显著高于对照组(P<0.05)。结论:采用含淤胆血清的"病理微环境"培养体系从经FGF-4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞样细胞。

射频消融治疗与经皮无水酒精注射对小肝癌治疗疗效比较的系统评价

目的评价射频消融治疗是否比经皮无水酒精注射治疗小肝癌具有更好的疗效。方法计算机检索MEDLINE(1966-2005年)、EMBASE(1989-2005年)、Cochrane图书馆临床对照试验资料库(2005年第1期)、互联网上注册临床试验数据库、中国生物医学文献数据库(1980-2005年),文献语种不限。纳入比较射频消融治疗和经皮无水酒精注射治疗小肝癌的随机对照试验,对纳入研究的方法学及质量进行评价,并应用RevMan4.2软件进行统计分析。结果共纳入4个随机对照试验。Meta分析结果表明,射频消融治疗较经皮无水酒精注射能提高对>2cm小肝癌的3年生存率、1年和3年无瘤生存率并减少1年和3年局部复发率;而对直径≤2cm的小肝癌,射频消融治疗与经皮无水酒精注射治疗效果相似,无显著差异。结论射频消融治疗小肝癌的总体疗效优于经皮无水酒精注射治疗,尤其对于肿瘤直径>2cm的小肝癌;且两种方法副作用均小,安全可靠。上述结论对于指导临床治疗小肝癌的方法选择具有很好的意义。

miRNA-122促进小鼠胚胎干细胞源性肝前体细胞的分化与成熟

目的:通过miRNA-122(miR-122)转染胚胎干细胞(ESCs)源性肝前体细胞,观察及评估其是否能推进ESCs向肝细胞的分化过程。方法:采用丁酸钠、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)及地塞米松(Dex)联合序贯诱导小鼠ESCs使之初步分化为肝前体细胞,然后利用Gateway技术构建出pAV.Ex1d-CMV>miR122/IRES/eGFP重组腺病毒表达载体,使其转染贴壁诱导第9天的小鼠ESCs源性肝前体细胞,获得稳定高表达miR-122的细胞后继续培养。采用荧光显微镜观察转染后细胞形态的变化;使用real-time RT-PCR检测肝特异性基因的表达;免疫荧光检测肝特异性蛋白表达水平;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验检测肝细胞功能。结果:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞。转染miR-122后,细胞在形态学上更接近成熟肝细胞;肝特异性基因白蛋白(ALB)、甲状腺素运载蛋白、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞角蛋白8、胆固醇7α-羟化酶及细胞色素P450 3A4的mRNA表达均增高;肝特异性蛋白ALB及细胞角蛋白18均表达增高,而甲胎蛋白表达降低;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验结果均显示转染miR-122后肝细胞功能较对照组明显增强。结论:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞;miR-122能够有效地促进小鼠肝前体细胞的分化与成熟。

左侧胎儿横纹肌样肾母细胞瘤1例分析

患者男,2岁6个月,2010年3月8日因＂发现左侧腹部包块10d＂入院,入院时食欲胃纳好,无发热,无咳嗽、无咳痰,大小便通畅,无血尿,无尿频尿急。入院查体：神清、精神好,营养中等,

SMYD3过表达对人肝内胆管癌细胞miR-124表达及细胞增殖的影响

目的:探讨肝内胆管癌细胞HCCC-9810中SET和MYND结构域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3)过表达对miR-124表达及细胞增殖能力的影响。方法:瞬时转染SMYD3真核表达质粒后,Western blotting检测细胞中SMYD3蛋白水平的变化;qRT-PCR检测细胞中SMYD3 mRNA和miR-124表达;甲基化特异性PCR检测miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化水平;CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:以空白组为对照,肝内胆管癌细胞HCCC-9810在转染pEGFP-SMYD3质粒后,SMYD3蛋白及mRNA表达均显著上升(P<0.05),miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化显著增加(P<0.05),miR-124表达明显下降(P<0.05),细胞增殖能力显著提高(P<0.05)。结论:过表达SMYD3可引起miR-124基因启动子甲基化增加,导致胆管癌细胞中miR-124的表达下降,同时过表达SMYD3可增强细胞增殖能力。

MYCN-siRNA和神经生长因子联合诱导神经母细胞瘤细胞分化凋亡的实验研究

目的:探讨应用MYCN-siRNA和神经生长因子(NGF)联合诱导神经母细胞瘤细胞分化凋亡的分子机制。方法:实验分组包括MYCN-siRNA与NGF联合诱导组、NGF诱导组、siRNA诱导组和空白对照组。观察各实验组神经母细胞瘤细胞的形态学变化及细胞的增殖变化,通过Real-TimePCR检测MYCN-mRNA和NSE的表达、Western Blot检测MYCN基因沉默后MYCN蛋白的表达情况。结果:神经母细胞瘤MYCN基因沉默后,RT-PCR检测IMR-32细胞MYCN-mRNA表达的抑制率达到89%;Western Blot检测IMR-32转染MYCN-siRNA后的第3天MYCN蛋白的表达率达到最低,表达率下降至26.6%。在NGF和MYCN-siRNA的共同作用下,神经母细胞瘤细胞出现了较明显的细胞形态学分化,细胞的增殖能力明显下降,IMR-32细胞NSE的表达明显下降。结论:MYCN-siRNA和NGF联合诱导神经母细胞瘤细胞,可使MYCN-mRNA的表达和NSE的表达均明显下降,并促进神经母细胞瘤细胞分化凋亡。

载阿霉素葡聚糖纳米粒的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用研究

目的制备载阿霉素葡聚糖纳米粒(DOX/DEX-PLA),观察其药物缓释规律,探讨其对人肝癌细胞的杀伤作用。方法以双乳化剂蒸发法制备DOX/DEX-PLA载药纳米粒,透射电镜观察纳米粒形态,分光光度法计算载药率,体外药物释放实验考察纳米粒对DOX的缓释作用。MTT法观察对肝癌细胞的体外杀伤作用,动物实验观察其体内抑瘤效应。结果DOX/DEX-PLA纳米微粒呈球形,粒径约83nm,药物包封率约67·1%。体外释放实验提示,纳米制剂中约50%的药物持续缓慢释放;体内抑瘤实验显示,纳米缓释制剂间隔给药疗效优于未包载药物每日给药的疗效。结论DOX/DEX-PLA纳米粒可有效抑制肝癌细胞的生长。

制度环境和权益资本成本——来自中国省际数据的比较研究

本文以中国237家非金融上市公司2004-2007年组成的平衡面板数据（共948个观察值）为研究样本，在控制相关变量的基础上，应用一系列GLS从政府关系、法律制度环境、金融市场发育程度和产品市场发育程度四个维度实证检验制度环境如何影响公司权益资本成本。实证结果表明，制度环境是影响权益资本成本的重要因素。具体而言：（1）政府关系与权益资本成本显著负相关；（2）法律制度环境与权益资本成本显著负相关；（3）金融市场发育程度与权益资本成本显著负相关；（4）产品市场发育程度与权益资本成本显著负相关。