组织工程化软骨组织形成的最佳细胞浓度和最佳形成时间的实验研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内形成的最佳细胞浓度和最佳形成时间。方法取贵州香猪部分耳廓软骨组织体外消化分离软骨细胞，与可注射性生物材料Ｐｌｕｒｏｎｉｃ混合形成复合物，浓度为１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０×１０６／ｍｌ，将细胞－生物材料复合物接种于猪自体腹外侧壁皮下。第６周取材，分别称重，并作ＨＥ、ＳａｆｒａｎｉｎＯ染色，评价软骨组织形成的最适细胞浓度。参考上述实验结果，制成最适软骨细胞－生物材料复合物，接种到猪自体腹外侧壁皮下，分别在接种后第１、３、６、９和１５周取材，大体观察，并作ＨＥ、ＳａｆｒａｎｉｎＯ染色，确定软骨组织形成的最佳时间。结果在动物自体内形成的软骨组织，与正常软骨组织有相似的组织学特性，形成软骨组织最适细胞浓度为５０×１０６／ｍｌ，最佳形成时间是第６周。结论成功地利用组织工程技术在具有免疫功能的自体动物体内形成了软骨组织，并确定了软骨组织形成的最佳细胞接种浓度和接种的软骨组织形成最佳时限。

自体组织工程化软骨组织在体内最佳形成时间的研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内最佳形成时间 ,为临床应用提供理论研究和参数。 方法取猪耳廓软骨细胞 ,与可注射性生物材料PluronicF12 7混合形成浓度为 5 0× 10 6 /ml细胞—生物材料复合物 ,接种于猪自体腹外侧壁真皮下 ,分别在接种后第 1、3、6、9、15周取材 ,从组织学、生化组成对再生软骨组织进行评价。 结果第六周形成的软骨组织完全成熟 ,与正常软骨组织有相似的组织学特性。而第 1、3周大部分为未成熟的软骨细胞。各不同时间再生软骨组织中氨基糖氨多糖 (GAG)占组织干重的平均百分含量在 7.0～ 9.0之间。第 6周形成软骨组织中Ⅱ型胶原含量比第 1、3周形成软骨组织中Ⅱ型胶原含量高 ,和正常耳软骨含量接近。 结论利用组织工程技术可在具有免疫功能自体动物内形成软骨组织 ,确定软骨组织形成的最佳时间为接种后第 6周。

携带人TGF-β_1腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。

胚胎来源的同种异体组织工程化软骨形成的研究

目的研究探讨同种异体组织工程化软骨在动物体内形成。方法取怀孕 100 d胚胎羊的关节软骨经体外制成细胞生物材料复合物，并注射到异体羊腹壁皮下，每隔 2周取材，连续半年，对所取标本进行评价。结果在同种异体动物体内能形成软骨组织并与正常软骨组织有相似的组织学特性。第 2、 4周的软骨组织有一定程度的免疫排斥反应和炎症细胞浸润。第 6周免疫反应减轻。结论应用组织工程技术可在同种异体动物体内再生软骨组织，再生的组织周围存在一定程度的免疫反应，随接种时间的延长而逐渐减弱。

重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs及对其增殖的影响

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)表达及对其增殖的影响。方法重组adeno-hTGF-β1转染猪BMSCs,转染72h后以酶联免疫吸附分析(ELISA)方法定量检测重组腺病毒转染后hTGF-β1蛋白的表达,MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性,及MTT法检测转染后对BMSCs增殖的影响。结果转染72h,BMSCs表达hTGF-β1蛋白量是转染Adeno-lacZ的BMSCs2.65倍(P<0.05);MV-1-Lu细胞生长抑制率测定显示BMSCs分泌的hTGF-β1蛋白有生物学活性,MTT法检测结果提示adeno-hTGF-β1转染BMSCs的增殖能力较对照组弱。结论转染重组adeno-hTGF-β1的BMSCs表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白,hTGF-β1蛋白对BMSCs的增殖有一定的抑制作用。

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓内的一种多能干结缔组织前体细胞,具有多向分化潜能,也是最有可能成为软骨组织工程的种子细胞来源。本文从BMSCs诱导成软骨细胞的方法和研究进展做一综述,如体外细胞团聚集诱导培养、体外单层细胞诱导培养、体外三维支架环境中诱导培养、体内软骨微环境诱导培养、和软骨细胞体外共培养诱导以及基因转染诱导培养等,这也是软骨组织工程研究中不可缺少的重要环节。

重组hTGF-β_1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用,为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的真核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组),RT-PCR、Northern-Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF-β1调节体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原表达的变化。结果:TGF-β1基因转染软骨细胞后,其Ⅱ型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且随着TGF-β1蛋白表达的丧失,其对软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论:TGF-β1可以上调体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。

软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响

目的:探讨体外培养猪耳软骨细胞在老化过程中,软骨蛋白聚糖(aggrecan)的代谢状况与分子结构的变化及其水解酶(aggrecanase)表达水平的改变。由此进一步阐明aggrecan在组织工程软骨构建中起决定性的作用。方法:取体外培养P1-P8各代猪耳软骨细胞及其培养液,爱茜蓝(Alcian Blue)法检测培养液中蛋白聚糖的含量和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)的分子结构。RT-PCR检测aggre-canase-1和-2的mRNA表达水平。结果:在P1细胞的培养液中,蛋白聚糖的含量和长链/高度硫酸化的GAG含量都是最高的。由P4细胞开始,这2项指标均显著减少(P<0.01),且两者的变化趋势有显著的相关性(P<0.01)。Aggrecanase-1 mRNA在前3代细胞基本无表达,P4细胞中有显著上升(P<0.01),随后逐渐减少,P8细胞又不再表达。Aggrecanase-2 mRNA的表达呈随机状态,与细胞代数无显著性相关(P>0.05)。结论:体外培养软骨细胞的老化对aggrecan的代谢有非常大的影响。一方面aggrecan的合成减少、大分子聚合物形成受阻;另一方面胞外基质的水解作用加剧,最终导致老化细胞的基质崩解。

组织细胞中胶原蛋白的提取及ECL-Western blot分析

目的建立一种可简便、有效的胶原蛋白提取、纯化及型别分析的测定方法。方法用破碎、酶解和盐析3步法提纯胶原,用ECL-Westernblot测定细胞基质胶原(200例)、正常组织及工程化修复组织中的胶原(30例)。结果该法提取胶原的时间周期短,得率高于传统方法的2.5倍,纯度达到了PAGE纯化的水平。结论该法具有简便、快速、灵敏和无放射性污染等优点,为组织工程胶原的深入研究提供了有价值的测试手段。

胰岛素样生长因子1受体抗体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察胰岛素样生长因子1受体抗体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法球囊导管损伤大鼠一侧颈总动脉,7天后体外培养受损血管的中膜平滑肌细胞,以损伤侧血管细胞为实验组,以对侧正常血管中膜平滑肌细胞为对照组;采用-αactin免疫细胞化学法进行细胞鉴定;在细胞的培养悬液中加入不同浓度的胰岛素样生长因子1受体抗体作用24 h,然后采用5-溴-2脱氧尿苷细胞增殖检测法检测细胞的增殖程度。结果大鼠颈总动脉球囊损伤后,体外培养的中膜平滑肌细胞表现出显著的增殖性(与对照组比较,P<0.01);胰岛素样生长因子1受体抗体可以显著抑制大鼠平滑肌细胞的增殖,呈现出浓度依赖性特征(组间比较,P<0.01)。结论胰岛素样生长因子1受体抗体具有抑制平滑肌细胞增殖的作用,有望用于治疗平滑肌细胞增殖性疾病。

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体。方法 eNOS的cDNA插入pcDNA3.1(-)中,进行DNA测序、酶切鉴定;插入片段用Xbal和AflⅡ双酶切后连接到pshuttle中,并予酶切鉴定;用P1-sce Ⅰ和Ⅰ-ceu Ⅰ双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体,通过PCR鉴定。结果 正确构建重组eNOS腺病毒表达系统,并被目的基因的PCR鉴定证实。结论 重组腺病毒表达载体构建正确,为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础。

同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的 以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异。方法 以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下。按不同时间段取材,Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较。结果 新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而Ⅱ型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异。结论 胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中Ⅱ型胶原的含量与正常关节软骨接近。

b-FGF和TGF-β1对体外培养的软骨细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的软骨细胞增殖的影响。方法:细胞取自猪耳弹性软骨,体外培养原代至第6代软骨细胞,将培养液中加入TGF-β1或/和b-FGF作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨两种因子对软骨细胞增殖行为的影响。结果:b-FGF明显促进原代至第3代软骨细胞的增殖,并逐渐减弱,对第4代细胞无增殖作用,TGF-β1仅促进原代软骨细胞的增殖,TGF-β1和b-FGF联合应用,其刺激细胞增殖的作用明显低于b-FGF单一作用。结论:b-FGF显著促进体外培养的软骨细胞的增殖,主要作用于原代至第2代软骨细胞,明显强于b-FGF和TGF-β1联合应用。

猪软骨细胞老化过程中Aggrecan的表达及其糖链分子结构的改变

本实验旨在探讨体外培养软骨细胞在老化过程中 ,aggrecan的表达水平与分子结构的变化及其间的相互关系。取体外培养P1～P5各代猪耳软骨细胞 ,RT PCR检测aggrecan球间区域 (interglobulardomain ,IGD)mRNA的表达状况 ;阿利新兰 (AlcianBlue)法检测糖胺聚糖 (glycosaminoglycan ,GAG)的含量和糖链的分子结构。结果显示aggrecanIGDmRNA的表达在P4、P5细胞内明显降低 (P <0 0 5 ) ;GAG的合成也在P4、P5时显著减少 (P <0 0 5 ) ,但这 2项指标的变化趋势之间无显著相关性。而长链 高度硫酸化的GAG由P4软骨细胞开始 ,绝对含量和相对含量均显著减少 (P <0 0 1) ,其与aggrecanIGDmRNA的变化趋势有显著相关性 (P <0 0 1)。由此可见 ,体外培养软骨细胞中ag grecan的表达合成和细胞老化有密切关系。aggrecanIGDmRNA的表达降低与aggrecan中长链 高度硫酸化GAG的合成代谢过程受阻可能是影响老化细胞成软骨能力的重要因素之一。

重组hBMP7基因转染成纤维细胞及其表达

目的 探讨重组骨形态发生蛋白-7腺病毒载体(AdCMV-BMP7)在人真皮成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法重组腺病毒载体AdCMV-BMP7经293细胞包装、扩增后,转染人真皮成纤维细胞。转染48 h后以免疫组织化学、RT-PCR等方法检测hBMP7基因在人真皮成纤维细胞内的表达情况。结果 在合适的滴度下,重组腺病毒载体AdCMV-BMP7对成纤维细胞的增殖能力无明显影响。转染48 h后免疫细胞化学显示已转染AdCMV-BMP7的成纤维细胞内有大量的hBMP7表达,RT-PCR也检测到特异的hBMP7基因片段的表达。结论 重组腺病毒载体AdCMV-BMP7能够被转导入成纤维细胞内,并稳定表达hBMP7。

人皮肤角朊细胞具有Leu 7、Leu 11抗原

本文用ABC法检测了9例寻常性银屑病患者皮损处表皮和4例正常人左前臂伸测表皮与McAb Leu7、Lcull的反应性。结果显示人表皮的角朊细胞能与这二种McAb反应,反应主要发生在角朊细胞的细胞浆,其反应强度和频率以基底细胞层处最强,随着细胞的分化此种反应渐减弱,至角质层处消失。角朊细胞与二种McAb的反应在银屑病和正常人皮肤之间无差别。

智能聚合物与人类软骨细胞相容性的实验研究

目的 研究改性后的医用聚丙烯材料的细胞毒性。方法 采用MTT法 ,对不同接枝率的复合智能聚合物与人类软骨细胞之间的细胞相容性进行了实验研究。结果 接枝率为 46 %的PP/NIPAAm膜 ,6 5 %、10 6 7%及 143 %的PP/NIPAAm/AAc/RDGS膜 ,均有较好的细胞相容性。

壳聚糖-明胶多孔复合支架构建自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的 探讨壳聚糖 明胶多孔复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法 消化分离猪耳廓软骨细胞 ,接种于自制壳聚糖 明胶多孔复合支架上培养 1周 ,将细胞 生物支架复合物种植于猪自体腹外侧壁皮下 ,第 10、16周取材 ,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学对再生软骨组织进行评价。结果 HE染色见 10周时有软骨组织形成 ,所形成的软骨组织见软骨细胞均匀分布 ,包埋在软骨陷窝内 ,还可见未降解的支架材料。 16周时软骨组织完成成熟 ,软骨细胞包埋在软骨陷窝内 ,支架材料完全降解 ,结构与正常软骨组织相似。Masson′strichrome染色见所形成的软骨组织间质中都有被染成绿色的胶原分布。Vehoeff染色见 16周时形成的软骨间质内含大量被染成蓝黑色弹性纤维。免疫组化证实形成的软骨组织有Ⅱ型胶原分布 ,生物化学证实所形成的软骨组织的蛋白聚糖含量与正常猪耳软骨的含量接近。结论 利用自制壳聚糖 明胶多孔复合支架上可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织 ,但形成的软骨不充分 ,壳聚糖 明胶多孔复合支架有以作为软骨组织工程支架的应用前景。

壳聚糖作为组织工程软骨支架的实验研究

目的 探索壳聚糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。 方法 消化分离猪耳郭软骨细胞 ,接种于自制壳聚糖、壳聚糖 胶原复合多孔支架上培养 ,从光镜和扫描电镜观察其亲水性和对细胞吸附力 ,MTT检测软骨细胞在壳聚糖、壳聚糖 胶原上的黏附率及壳聚糖、壳聚糖 胶原复合多孔支架对细胞的增殖、功能的影响。 结果 软骨细胞能够在壳聚糖、壳聚糖 胶原支架上黏附、伸展、增殖和发挥正常功能 ,MTT测得细胞黏附率分别为 81 2 5 %和 87 5 0 % ,MTT测得软骨细胞在壳聚糖 胶原支架中的增殖能力较强。 结论 壳聚糖、壳聚糖 胶原复合多孔支架与软骨细胞具有较好的相容性 ,壳聚糖 胶原复合多孔支架更适合作为软骨组织工程中的细胞培养支架。