连翘脂素对脂多糖联合正常人血浆诱导的A549细胞炎症损伤的作用

目的通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合正常人血浆(NHP)刺激A549细胞,探究连翘脂素(phillygenin,PHI)对A549细胞炎症损伤的干预作用及机制。方法采用1 mg·L^(-1)LPS联合5%NHP刺激A549细胞建立炎症损伤模型。MTT和Hoechst 33342染色检测PHI对细胞活力、数目、面积、形态和DNA含量的影响。采用ELISA、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测炎症因子、NF-κB p65入核及mRNA表达;Western blot检测NF-κB和MAPK关键蛋白表达。结果LPS联合NHP共刺激组IL-6、IL-8含量及NF-κB p65核内转录活性明显上调;PHI(1、10、50和100μmol·L^(-1))可以剂量依赖性降低IL-6和IL-8表达、NF-κB p65核内转录活性及p65 mRNA表达,明显下调IκBα、p65及p38、JNK、ERK蛋白磷酸化水平,上调IκBα表达。结论LPS联合NHP可以成功诱导A549炎症损伤模型,PHI可抑制该炎症反应,其机制与抑制LPS-TLR4-NF-κB/MAPK信号通路的活化有关。

基于高内涵分析技术研究山萘酚的人肾近曲小管细胞HK-2毒性及机制

目的基于高内涵分析技术探究山萘酚的肾细胞毒性作用及机制。方法人肾近曲小管细胞HK-2分为细胞对照组(二甲亚砜终浓度<0.01%)、山萘酚5,10,20,50和100μmol·L^(-1)组及多柔比星(Dox)10μmol·L^(-1)组。Hoechst 33342染色和噻唑蓝(MTT)比色法分别检测活细胞数目和细胞存活率;荧光探针DCFH-DA,Mito-Tracker Red CMXRos和Fluo-4 AM分别检测活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)和Ca^(2+)内流水平;化学发光法检测细胞ATP含量;AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡率;Hoechst 33342染色检测DNA含量;免疫荧光法检测NF-κB p65入核情况,以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路蛋白〔p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、c-Jun N端激酶(JNK)、p-JNK、细胞外信号调节激酶(ERK)和p-ERK〕和酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)通路蛋白(p-STAT3和STAT3)的表达。结果与细胞对照组相比,山萘酚5,10,20,50和100μmol·L^(-1)组活细胞数目明显减少(P<0.05,P<0.01);山萘酚10,20,50和100μmol·L^(-1)组细胞存活率显著下降(P<0.05,P<0.01);山萘酚10,20,50和100μmol·L^(-1)组细胞ROS水平升高(P<0.05,P<0.01);山萘酚5,10,20,50和100μmol·L^(-1)组细胞MMP下降(P<0.01);山萘酚50和100μmol·L^(-1)组细胞Ca^(2+)内流水平明显升高(P<0.05,P<0.01),ATP含量明显降低(P<0.05,P<0.01);山萘酚20,50和100μmol·L^(-1)组细胞凋亡率均明显升高(P<0.05,P<0.01);山萘酚各剂量组DNA含量均无明显变化。免疫荧光检测结果显示,山萘酚50和100μmol·L^(-1)使NF-κB p65发生磷酸化并入核;山萘酚上调MAPK通路p-p38 MAPK,p-ERK,p-JNK和JNK蛋白及JAK2/STAT3通路p-STAT3蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论山萘酚对HK-2细胞有明显毒性,机制与其促进ROS水平升高而介导氧化应激损伤和细胞凋亡有关。

A型肉毒毒素轻链肽类抑制剂CPI-1衍生物的合成及解毒活性评价

目的合成多肽CPI-1的N端或C端衍生物并进行活性评价,以获得活性更高、药动学性质更好的A型肉毒毒素(BoNT/A)轻链抑制剂。方法采用固相方法合成CPI-1 C端增加不同氨基酸的非长链衍生物〔CPI-1-L(1),CPI-I-GL(2),CPI-1-W(3),CPI-1-Y(4),CPI-1-R(5),CPI-1-K(6)和CPI-1-E(7)〕及C端或N端引入长链脂肪酸的长链衍生物〔CPI-1-K(stearic)GG(8),CPI-1-LK(stearic)GG(9),CPI-1-LGK(stearic)GG(10),C_(8)-CPI-1(11),C_(12)-CPI-1(12),C_(14)-CPI-1(13)和C_(16)-CPI-1(14)〕。线性肽CPI-1及非长链修饰衍生物完成固相合成后,脱除保护基后在NH_(4)HCO_(3)溶液中氧化折叠成环状目标肽;CPI-1长链修饰衍生物线性肽完成固相合成后,在树脂上直接碘氧化关环,然后裂解。各粗肽经高效液相色谱法(HPLC)纯化后得到目标肽。采用荧光共振能量转移法测定目标多肽对轻链片段LC424的抑制活性,HPLC测定多肽对胰蛋白酶酶解的稳定性。小鼠随机分为毒素组、毒素+CPI-1组及毒素+CPI-1衍生物组,①将生理盐水、5 mg·kg^(-1) CPI-1或CPI-1衍生物分别与2×LD_(50)(或2.5×LD_(50))BoNT/A孵育后ip给予小鼠,测定72 h内小鼠存活率;②以2×LD_(50) BoNT/A攻毒2和6 h后,分别给予生理盐水和5 mg·kg^(-1) CPI-1或CPI-1衍生物进行解救,观察72 h内小鼠存活率。结果共合成14个CPI-1衍生物,其中7个非长链修饰衍生物,7个长链修饰衍生物,经质谱鉴定相对分子质量正确。LC424抑制实验结果表明,CPI-1 C端引入疏水氨基酸亮氨酸(CPI-1-L)、色氨酸(CPI-1-W)、酪氨酸(CPI-1-Y)及碱性氨基酸精氨酸(CPI-1-R)后,其对轻链的抑制活性(IC_(50)=0.06~0.15μmol·L^(-1))较CPI-1提高3.5~0.8倍(P<0.01),引入酸性氨基酸谷氨酸(Glu)(CPI-1-E)抑制活性(IC_(50)=1.26±0.28μmol·L^(-1))降低78.6%(P<0.01);C端或N端引入长链脂肪酸修饰后抑制活性(IC_(50)>1.36μmol·L^(-1))下降>80%(P<0.01)。酶降解稳定性实验结果表明,C端或N端引入长链脂肪酸修饰后,CPI-1-K(stearic)GG和C_(12)-CPI-1的8 h胰蛋白酶降解率显著降低(P<0.05,P<0.01)。小鼠实验结果表明,2×LD_(50) BoNT/A与CPI非长修饰衍生物共孵育30 min后ip给予小鼠,与毒素组相比,毒素+CPI-1组小鼠72 h内存活率无明显差异;毒素+衍生物CPI-1-L,CPI-1-W,CPI-1-Y,CPI-1-R和CPI-1-K组小鼠72 h内存活率明显提高(P<0.05),且与毒素+CPI-1组相比也均明显提高(P<0.05);2.5×LD_(50) BoNT/A与CPI长链修饰衍生物共孵育30 min后ip给予小鼠,与毒素组相比,毒素+CPI-1组及毒素+衍生物CPI-1-LK(stearic)GG、C_(12)-CPI-1、C_(14)-CPI-1和C_(16)-CPI-1组小鼠72 h内存活率明显提高(P<0.05),毒素+衍生物CPI-1-K(stearic)GG,CPI-1-LGK(stearic)GG及C_(8)-CPI-1组无明显差异;与毒素+CPI-1组相比,毒素+衍生物各组均无明显差异。2×LD_(50) BoNT/A攻毒2和6 h后给予CPI衍生物进行解救,与毒素组相比,毒素+C_(12)-CPI组小鼠72 h内存活率明显提高(P<0.05),毒素+CPI-1及其余衍生物组无明显差异;与毒素+CPI-1相比,毒素+各衍生物组小鼠72 h内存活率均无明显差异。结论CPI-1 C端引入疏水或碱性氨基酸可提高对轻链的抑制活性,C端脂肪链修饰衍生物抗酶解能力增强,N端月桂酸修饰衍生物在小鼠体内具有明显的抗BoNT/A活性。

补体旁路激活导致内皮细胞活化和损伤

目的研究补体替代途径的激活对血管内皮细胞活化和损伤的作用。方法采用眼镜蛇毒因子(CVF)与人血清孵育,特异激活补体替代途径。将孵育物作用于人微血管内皮细胞,采用ELISA检测内皮细胞P-selectin、E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的表达,采用酶活性测定法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,化学发光法检测内皮细胞caspase-8活化信号,MTT法检测内皮细胞增殖活性,并检测内皮细胞释放NO的变化。结果补体旁路激活导致内皮细胞瞬时表达P-selectin,并进而使内皮细胞上调表达E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8。内皮细胞经补体激活物刺激后,LDH释放增加、凋亡信号caspase-8活化上调以及NO释放下调,同时,细胞增殖也受到抑制。结论补体旁路激活能诱导内皮细胞活化和损伤,介导血管内皮的生理结构与功能发生变化,从而可能导致相应的炎症和组织损伤。

眼镜蛇毒高活性抗补体因子的体外溶血活性研究

目的 了解云南孟加拉眼镜蛇毒高活性抗补体因子的体外溶血活性。方法 采用由豚鼠血清、豚鼠红细胞和该抗补体因子组成的体外溶血体系 ,对其溶血活性、溶血活性稳定性以及多种二价金属离子、EDTA对其溶血活性的影响进行研究。结果 该抗补体因子溶血活性的比活力为 1 391KU·g- 1 ,其溶血活性对温度、酸碱表现出较好的稳定性 ,1、2、5mmol·L- 1 的Ca2 + 、Mg2 + 、Mn2 + 能促进抗补体因子的溶血活性 ,1、2mmol·L- 1 的Zn2 + 、Co2 + 能促进抗补体因子的溶血活性 ,而 5mmol·L- 1 的Zn2 + 、Co2 + 则抑制抗补体因子的溶血活性 ,Cu2 + 在 1、2、5mmol·L- 1 时则强烈抑制抗补体因子的溶血活性 ,EDTA能强烈抑制抗补体因子的溶血活性。结论 云南孟加拉眼镜蛇毒高活性抗补体因子具有一定的溶血活性 ,并且具有较好的温度耐受性及酸碱稳定性。

小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法

目的针对现有补体溶血活性测定方法不适宜测定小鼠血清补体的缺点,构建一种血清用量少、灵敏度高的小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法。方法选用具有代表性的3个小鼠品系KM、BALB/c和C57BL/6小鼠的血清补体作为测定材料,以兔红细胞为溶血靶细胞,利用眼镜蛇毒因子(CVF)特异激活补体替代途径的特点,构建和优化小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的方法,并采用该方法测定两种抗补体蛋白对小鼠体内血清补体活性的影响。结果以CVF作为激活剂成功构建了测定小鼠血清补体替代途径溶血活性的微量新方法。3个品系小鼠的血清在5～20μl的范围内即可分别达到合适的溶血度。该方法明显减少了血清用量,并能有效提高溶血度。结论基于CVF特异激活补体替代途径的特点而构建的小鼠血清补体替代途径溶血活性测定新方法,血清用量少、灵敏度高、稳定性好,适用于测定小鼠血清补体的溶血活性。

眼镜蛇毒中一个弱纤维蛋白原水解活性金属蛋白酶的纯化和性质研究(英文)

通过蛋白层析从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的纤维蛋白原水解酶atrase A. Atrase A是一个分子量为64.6 kD,等电点为pH9.6和中性糖含量为4.16 %的碱性单链糖蛋白.它具有弱的纤维蛋白原α链水解活性.该活性能被金属螯合剂EDTA,EGTA,1 ,10-phenanthroline和还原剂DTT完全抑制,而PMSF只能部分抑制该活性,大豆胰蛋白酶抑制剂对其没有影响,表明atrase A属于金属蛋白酶.Atrase A具有水肿活性和金黄色葡萄球菌抑制活性.它对A549和K562细胞没有细胞毒性,但能使贴壁生长的A549细胞解离悬浮. Atrase A没有纤维蛋白、azocasein 、BAEE水解活性,对ADP、胶原诱导的血小板聚集没有明确的抑制作用.经小鼠皮下注射后没有发现其有出血毒活性.

乙酰胆碱酯酶抑制剂微量筛选模型的比较研究

目的为新药发现阶段乙酰胆碱酯酶(acetylcholinest-erase,AChE)抑制剂的筛选提供实用的微量筛选方法。方法分别以电鳗AChE、大鼠大脑匀浆、蛇毒AChE为酶源,以96孔板为载体,在生理pH值和温度的条件下,用正交试验法研究酶浓度、底物浓度、反应时间、显色剂浓度对酶反应速率的影响,确定酶反应最佳条件。在研究样品溶媒DMSO对酶反应的影响和SDS终止酶反应的效果后,最终确定筛选模型运行条件并对492种贵州民族药植物提取物进行筛选研究。结果采用上述3种酶源均成功构建了微量化的AChE抑制剂筛选模型。筛选结果表明,电鳗AChE有较高的筛选灵敏度,而蛇毒AChE的筛选结果则与大鼠大脑匀浆的筛选结果有较好的一致性。结论以上述3种具有代表性的酶源构建的AChE抑制剂微量筛选模型均具备了简便、快速、可靠、经济、灵活的优点。其中电鳗AChE最适合用于新药发现阶段粗提物样品的筛选,而高纯度的蛇毒AChE更适合用于从化合物库中大规模筛选AChE抑制剂。

补体旁路激活导致内皮细胞活化及干预研究

补体是免疫系统的重要组成部分，在机体天然防御、免疫调控中发挥重要作用。但补体在诸多病理生理情况下的过度激活会引发炎症和组织损伤，尤其是补体旁路的过度激活在一系列疾病和病征的发生发展中扮演了重要角色。而构成血液天然屏障的血管内皮细胞则不可避免地成为补体激活的靶细胞和效应细胞。因此，

补体旁路激活导致内皮细胞炎症反应及干预

目的基于补体旁路与一系列病征的重要关联,研究补体旁路激活导致微血管内皮细胞发生的变化及干预.方法采用眼镜蛇毒因子特异激活血清补体旁路途径.将补体旁路激活产物作用于培养的人微血管内皮细胞,分别检测黏附分子、炎症介质、纤溶凝血相关分子的表达和炎症相关信号通路的活化,采用多种化学小分子对上述炎症反应进行干预.结果补体旁路激活产物刺激微血管内皮细胞后,炎症相关信号通路JAK2、p38MAPK和NF-κB先后出现活化高峰,P-selectin和vWF先后瞬时释放,黏附分子（E-selectin、ICAM-1、VCAM-1）、炎症介质（IL-8、MCP-1）、纤溶凝血相关分子（t-PA、PAI-1、TF）的表达上调,而TM和NO下调.AG490、SB203580、PDTC以及白藜芦醇对内皮细胞的炎症反应表现出多样的干预作用及影响.结论补体旁路激活能导致微血管内皮细胞发生炎症反应,从而介导微血管内皮的生理结构与功能发生炎性变化;相关化学小分子能在一定程度上干预上述炎症反应,提示JAK2可能是一个重要的调控位点.

脂糖激活补体诱导内皮细胞释放粘附分子和凋亡

目的：在细胞水平上研究脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）激活血清补体对内皮细胞的作用和影响，进一步探讨临床上常见的细菌感染释放内毒素引发炎症的作用和机理，为相关临床防治策略、新药研发提供有益的思路和有价值的参考。方法：研究LPS激活血清补体的作用方式和特点，观察LPS激活补体对内皮细胞表达粘附分子和凋亡的影响。

眼镜蛇毒PⅢ型金属蛋白酶AtraseB结构与功能研究进展

研究目的：探讨眼镜蛇毒金属蛋白酶的结构与功能的关系以及其生物学意义，丰富和拓展对眼镜蛇毒金属蛋白酶结构与功能的认识和理解，促进对相关科学问题的认识，为蛇伤防治策略提供有益的参考和新的思路，

补体旁路过度激活影响体内凝血功能

目的研究补体旁路的过度激活对体内纤溶、凝血及血小板的影响。方法采用尾静脉注射眼镜蛇毒因子(CVF)造成大鼠体内补体旁路的过度激活。检测大鼠给药前和给药后多个时间点血样的补体活性、t-PA、PAI-1、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)、P-selectin、PF-4、β-TG、血小板数量及聚集活性的变化,并检测小鼠静脉给予CVF后其尾部出血时间的变化。结果大鼠注射CVF后,血清补体活性在1h内基本消失。t-PA和PAI-1含量在1h内有明显增加,在48 h时间点t-PA/PAI-1比值有明显下降(P<0.01);PT、APTT、TT均略有变化,而血浆FIB含量明显下降;补体旁路的过度激活导致血中P-selectin、PF-4、β-TG明显上调,血小板数量明显减少,凝血酶和花生四烯酸诱导的血小板聚集被明显抑制,而ADP诱导的血小板聚集只受到轻微影响。小鼠尾部出血时间在1 h时明显缩短。结论补体旁路的过度激活能明显影响体内凝血功能,导致血液的高凝状态。

野木瓜水溶性多糖的分离纯化及抗补体活性研究

采用水提醇沉工艺获得了水溶性野木瓜粗多糖(CCP),经过Sevag法脱蛋白,大孔树脂脱色及透析,得到野木瓜精多糖,再经DEAE-纤维素和Sepharose Cl-6B柱层析,从野木瓜中分离得到多糖组分CCP1,经过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)鉴定为均一组分,测定其相对分子量(MW)为2.879×106D。高效液相法测定CCP1的单糖组成为:鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖,其摩尔比为0.034:0.228:0.045:0.055:0.638。补体结合实验表明,多糖CCP1在体外具有一定抗补体活性,并呈一定的剂量效应关系。

杜仲叶多糖的提取分离、抗补体活性及结构研究

经石油醚脱脂、除胶后,采用热水提取、分步醇沉工艺获得杜仲叶水溶性多糖PsEUL1、PsEUL2、PsEUL3,分别经S-8大孔树脂脱色,Sevag法脱蛋白及透析,其中PsEUL1经DEAE-52纤维素柱层析分离得多糖组分PsEUL11、PsEUL12、PsEUL13,抗补体活性实验表明,其中有多个组分有不同程度的抗补体活性,并呈一定的剂量效应关系。活性多糖PsEUL13经硫酸-咔唑反应及气相色谱法测定,单糖组成为:L-鼠李糖、D-岩藻糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡糖糖、D-半乳糖、糖醛酸,含量比为11.8∶1.6∶37.7∶4.2∶10.7∶12.8∶21.2。

阿托伐他汀减轻氧化型低密度脂蛋白导致的人微血管内皮细胞活化和损伤

目的研究阿托伐他汀(ATV)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)导致人微血管内皮细胞活化和损伤的抑制作用。方法采用ox-LDL激活和损伤人微血管内皮细胞。损伤前加入ATV与内皮细胞孵育。细胞暴露于ox-LDL后,MTT法测定细胞活力,酶活性测定法检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力,ELISA检测上清中ICAM-1含量,Western blot检测细胞质内NF-κB p65的磷酸化水平,并采用双萤光素酶报告基因检测系统测定NF-κB的核内转录活性。结果 OxLDL能导致人微血管内皮细胞的活化和损伤。ATV的干预可有效减轻ox-LDL对细胞活力的抑制、减少LDH释放、下调ICAM-1分子的表达、减弱细胞质内NF-κB p65的磷酸化、抑制NF-κB核内转录活性的上调。结论 ATV能有效减轻ox-LDL导致的人微血管内皮细胞活化和损伤,其机制可能与抑制NF-κB的磷酸化和核内转录活性有关。

毛子草化学成分及其促PC-12细胞的分化作用研究Ⅰ

目的:研究毛子草的化学成分及其促PC-12细胞的分化作用.方法:利用反复硅胶柱色谱进行分离和纯化,通过理化方法及光谱分析鉴定其结构.采用PC-12细胞株模型对毛子草不同提取部位及各单体化合物进行了促分化作用研究.结果:从毛子草的正丁醇溶解部分分离得到5个化合物,鉴定为:车前醚苷(Ⅰ),5-羟基-4',6,7-三甲氧基黄酮(Ⅱ),4',5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮(Ⅲ),4',5-二羟基-7-甲氧基黄酮(Ⅳ),5-羟基-4',7-二甲氧基黄酮(Ⅴ).结论:化合物Ⅰ为首次从该植物中分离得到;化合物Ⅱ～Ⅴ为首次从角蒿属植物中分离得到.生物活性表明毛子草正丁醇溶解部位和化合物Ⅰ对PC-12细胞均具有一定的营养活性.

绿原酸、咖啡酸、阿魏酸对微血管内皮细胞的损伤作用

微血管内皮细胞具有重要的生理功能.诸多因素会损伤微血管内皮细胞,从而导致微血管内皮功能的失衡,进而引起多种病征和损伤.其中,药物损伤是一个重要的因素.绿原酸（chlorogenic acid,CGA）是金银花、杜仲等药材中的重要活性成分,也是诸多中药民族药的质量控制的主要指标之一,同时也是具有重要应用开发前景的活性物质.

绿原酸对小鼠急性肺损伤的保护作用研究

本文探讨了绿原酸对补体旁路激活致小鼠急性肺损伤的保护作用及可能的作用机制。将32只KM小鼠随机分为正常对照组、模型组、白藜芦醇组、绿原酸组,预防给药7 d后,用特异性补体旁路激活蛋白眼镜蛇毒因子(CVF)尾静脉注射复制小鼠急性肺损伤模型。测定肺含水量、肺组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)活性、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞数目和蛋白含量,ELISA法检测BALF和血清中白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、P选择素(P-selectin)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量,HE染色法观察肺组织病理形态学变化,免疫组化法测定肺组织中NF-κB p65的磷酸化水平。研究发现,绿原酸可以降低小鼠BALF中蛋白含量、炎性细胞数目、IL-6和TNF-α含量以及肺组织匀浆中MPO活性,并可显著降低血清中IL-6、TNF-α及P-selectin、ICAM-1水平;病理形态学显示绿原酸可以显著抑制炎性细胞浸润,免疫组化结果显示绿原酸可显著抑制小鼠NF-κB p65的磷酸化水平。以上结果说明绿原酸可明显减轻补体旁路激活诱导的小鼠急性肺损伤,其机制可能与抑制NF-κB p65的磷酸化及降低炎症反应程度有关。

脂多糖激活补体诱导内皮细胞释放黏附分子和凋亡

目的在细胞水平上研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活血清补体对内皮细胞的作用和影响。方法研究LPS激活血清补体的作用方式和特点,观察LPS激活补体对内皮细胞表达黏附分子和凋亡的影响。采用ELISA检测内皮细胞释放P-selectin、E-selectin和ICAM-1的变化,化学发光法检测Caspase-3/7活化情况,SRB法检测LPS激活补体对内皮细胞生长的影响。结果 LPS能够激活血清补体,这种激活呈现量效、时效性。LPS激活血清补体可诱导内皮细胞瞬时明显释放P-selectin,E-selectin和ICAM-1表达也明显上调,同时可导致Caspase-3/7活化。在本实验条件下,LPS激活血清补体对内皮细胞生长未产生抑制。结论 LPS激活血清补体可损伤内皮细胞,导致内皮细胞明显表达黏附分子以及发生凋亡。