不同环境和营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌生长、产孢及几丁质酶表达的影响

[目的]研究温度、pH和不同营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)生长及产孢特性的影响,分析其在碳氮饥饿条件下几丁质酶的表达水平,优化该菌的培养条件,为该菌的扩大培养提供参考依据。[方法]将圆锥节丛孢菌AC-shz1菌株接种于YPSSA培养基,分别置于不同温度(15、20、25、30和35℃)、pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、碳源(果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、几丁质)、氮源(甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素)和碳氮比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)环境条件下进行培养,观察并记录菌丝的生长速度及形态,测定其产孢能力;在碳氮源饥饿条件下,采用实时荧光定量PCR方法对4种几丁质酶基因的表达水平进行分析。[结果]圆锥节丛孢菌在温度15~30℃均能生长,其中以25℃时菌丝生长最快且产孢能力最强;在pH为6.5~7.5时菌丝生长良好,其中以pH 7.0时产孢能力最强。圆锥节丛孢菌最适菌丝生长和产孢碳源为葡萄糖和蔗糖,其中含葡萄糖的培养基产孢量最高;最适氮源为酵母粉和蛋白胨,含酵母粉的培养基产孢量最高,以葡萄糖和酵母粉为碳氮源的最适碳氮比为5∶1。与对照组相比,在碳饥饿条件下,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-14(AC-14,P<0.01)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-190(AC-190,P>0.05)基因转录水平上调,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-379(AC-379,P>0.05)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-483(AC-483,P<0.01)基因转录水平下调;在氮饥饿条件下,上述4种几丁质酶基因转录水平均极显著下调(P<0.01)。[结论]菌丝生长和产孢最适温度为25℃,最适pH为7.0,最适碳氮源分别为葡萄糖和酵母粉,最适碳氮比为5∶1。本研究结果为进一步研发具有高效的捕食线虫真菌生物防控制剂奠定了基础。

少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492对线虫的降解作用研究

【目的】为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492的生物学功能。【方法】对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能。【结果】几丁质酶AO-492有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18家族结构域,并含有糖苷水解酶18家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构。系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近。SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492分子量约为59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应。ReAO-Z492最适温度为40℃,最适pH为7.0;Mg^(2+)对其酶活有促进作用,而Ag^(+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)和Zn^(2+)有抑制作用。ReAO-Z492对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性。【结论】少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492 对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用。

感染LM小鼠巨噬细胞外泌体的转录组测序及差异表达miRNA特征分析

[目的]分离和鉴定感染单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)小鼠巨噬细胞外泌体(Exosomes,Exos)并分析其miRNA表达谱,为揭示巨噬细胞Exos miRNA在LM感染中的调控机制奠定研究基础。[方法]以未感染LM的巨噬细胞为对照组,感染LM的巨噬细胞为试验组,采用超速离心法分离提取巨噬细胞上清中的Exos,通过透射电镜、纳米颗粒追踪技术和Western blot对Exos形态、大小及表面标志分子特征进行鉴定。利用Illumina SE50测序平台对2组巨噬细胞Exos miRNA进行Small RNA-seq测序,筛选出显著差异表达的miRNA。使用Targetscan、miRDB和miRWalk数据库对差异表达miRNA靶基因进行预测,并对差异miRNA靶基因进行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。利用Cytoscape软件绘制前20位Hub基因的miRNA-mRNA调控网络图。[结果]Exos直径为30~150 nm,具有典型的双层膜结构,Exos表面标志分子CD9、CD63和TSG101呈阳性表达。高通量测序结果显示,与对照组相比,试验组Exos中共筛选出9个显著差异表达的miRNA,其中显著下调基因8个(mmu-miR-7a-5p、mmu-miR-365-2-5p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-122b-3p、mmu-let-7i-5p、mmu-miR-151-3p、mmu-miR-182-5p和mmu-miR-1198-5p),显著上调基因1个(mmu-miR-192-5p),共预测miRNA调控靶基因1064个。GO富集分析结果显示,差异miRNA靶基因主要富集在轴突形成、细胞连接组装、肌动蛋白结合和金属离子跨膜转运等过程;KEGG分析显示,靶基因显著富集在cGMP-PKG信号通路和FcγR介导的吞噬作用通路。[结论]感染LM的小鼠巨噬细胞Exos miRNA表达谱发生了显著改变,其调控的潜在靶基因主要参与感染和免疫反应等信号通路。

sRNA GcvB对鼠伤寒沙门菌毒力的调控作用研究

小RNA(sRNA)是一种调节分子,可以在转录后水平调节基因表达,从而改变细菌的生理特征。为了研究sRNA GcvB在鼠伤寒沙门菌毒力中的调控作用,本研究构建了GcvB基因缺失株、互补株及示踪菌,检测其对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成及泳动能力的影响;分析亲本株与缺失株在毒力及感染动力学上的差异,预测并分析了GcvB调控的潜在靶基因,探究了GcvB对ST生物被膜、氧化应激和毒力的调控作用。结果显示,与亲本株和回补株相比,GcvB缺失后生物被膜形成能力升高、抗氧化应激能力显著增强;半数致死量(LD50)上升至3.98倍。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测靶基因gcvA、bapA、hilA、igaA及sitD,结果显示gcvA、bapA、igaA及sitD的转录水平表达量上调,而hilA下降。本研究证实sRNA GcvB参与了鼠伤寒沙门菌生物被膜形成、氧化应激和毒力作用,为揭示sRNA GcvB在ST生物被膜、氧化应激和毒力中的调控机制提供了研究基础。

捕食线虫性真菌圆锥节丛孢的分离鉴定及其捕食线虫活性的研究

为研发高效广谱的捕食线虫性真菌生物防控制剂,采集新疆石河子牧区和林区的土壤样品,进行捕食线虫性真菌的分离鉴定,将纯化后的菌株进行18s rRNA、ITS基因序列扩增及系统进化分析,并测定其捕食线虫活性。结果显示,分离的真菌(命名为AC-shz1)菌落为白色,菌丝无色;分生孢子梗无色直立、具有多个分隔,分生孢子呈球状着生于分生孢子梗顶端;分生孢子呈倒圆锥型,具有一个分隔,分隔处缢裂,与圆锥节丛孢(Arthrobotrys conoides)形态特征完全相符。系统进化分析显示,AC-shz1分离株与圆锥节丛孢同源性最高(100%),与OQ398107.1聚为一个分支。捕食线虫能力测定显示,AC-shz1菌株对秀丽隐杆线虫LⅢ幼虫的捕食效率活性可达96.7%,捕食器为黏性网;产孢数量在玉米粒培养基上最多,其产孢浓度为8.33×10^(10)个·mL^(-1)。表明分离到的圆锥节丛孢具有较强的产孢与捕食线虫活性,为高效生物防控制剂的研发奠定了前期研究基础。

地下水石油污染的原位空气曝气修复技术

针对东北某石油污染场地水文地质条件进行模拟,按照试验场地地层现状进行实验室缩放。选取苯和二甲苯作为目标石油污染物,采用电阻层析成像技术测定空气曝气技术的影响半径,研究非均质介质砾砂、粗砂和中砂条件下,空气曝气技术对苯和二甲苯的去除效果。实验结果表明:在非均匀介质中的影响半径不是围绕曝气井呈中心对称分布的,存在气体偏流和绕流现象。空气曝气技术(AS)对中砂层中苯和二甲苯的去除效果要比砾砂层和粗砂层的好;曝气15 d后,AS对苯和二甲苯的去除率分别为75.6%和71.3%。AS在去除污染物的过程中,存在明显的拖尾现象。

营养液pH值对非洲菊生长和生理特征的影响

以非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)为材料,采用水培的方法研究了营养液不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)对其生长发育的影响。结果显示:(1)在pH6.0条件下,非洲菊叶片和根系的鲜重、干重均最大,叶片数多于其他处理,且增加幅度较大;叶面积最大且叶面积增长最快。(2)随着培养天数的增加,pH4.0～7.0处理非洲菊的叶绿素含量均呈现先上升后下降的趋势,而pH8.0和pH9.0处理的叶绿素含量一直呈现下降的趋势;pH6.0处理的非洲菊在培养30 d时叶绿素含量极显著高于其他处理。(3)在培养45 d时,pH6.0处理的SOD活性极显著高于其他处理;随着培养时间的延长,根系活力在pH4.0～7.0处理呈持续上升趋势,在pH8.0和pH9.0处理呈先上升后下降的趋势。研究表明,在pH6.0的微酸性环境下非洲菊的生长状态良好,pH8.0和9.0的碱性环境对非洲菊的生长具有明显的抑制作用,其叶片发黄;培养介质pH值可能是非洲菊定植后叶片黄化的重要原因之一。

少孢节丛孢菌的分离鉴定及捕食线虫活性研究

为研究新疆地区捕食线虫性真菌的生物活性,本实验采用玉米粉琼脂培养基(CMA)培养分离自新疆不同地区的捕食线虫性真菌,通过对分离株纯培养物的形态学观察和18S rDNA基因序列分析,鉴定4株少孢节丛孢菌,分别命名为XA3、XA6、XD1和XD4。18S rDNA基因遗传进化分析表明,XA3、XA6、XD1和XD4新疆分离株之间同源性较高,与GenBank登录的少孢节丛孢菌CBS289.82株同源性最高,分别为99.6%、99.5%、99.1%和98.9%,与形态学鉴定结果一致。捕食线虫活性测定试验表明,4个分离株在CMA中的捕食率为92.8%～97.6%;体外对绵羊粪便中线虫幼虫的捕食率为90.7%～95.4%,均具有很强的捕食活性。本研究为研究绵羊消化道线虫生物防控制剂奠定基础。

人内耳蜗神经管的应用解剖学

目的：为临床人工耳蜗植人术提供解剖学依据。方法：观测30例(60侧)硅胶蜗神经管的长度和直径。观测15例(30侧)CT蜗神经管的长度和直径。结果：蜗神经管为位于内耳道底至耳蜗底之间的一个粗短的圆柱型管道。硅胶蜗神经管的长度为(1．69±0．34)mm,平均直径为(2．53±0．27)mm。CT蜗神经管平均直径为(2．20±0．30)mm,直径的正常参考值为(2．08～2．23)mm(95%可信区间)。结论：首次测得了CT蜗神经管直径的正常参考值,该数值可作为人工耳蜗植入术前评估的解剖学依据。

斯氏艾美耳球虫的致病性及病理学研究

用纯种斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊人工感染25只断奶幼兔,进行致病性和病理学研究。试验兔分为1个不感染对照组和4个感染组,各感染组每只幼兔分别口服感染2.0×103、1.0×104、5.0×104、2.5×105个孢子化卵囊。与对照组相比,接种2.0×103个和1.0×104个孢子化卵囊的两个感染组的平均病变记分、肝重指数、血清转氨酶活性有显著差异(P<0.05);接种5.0×104个和2.5×105个孢子化卵囊的两个感染组上述指标有极显著差异(P<0.01)。表明斯氏艾美耳球虫对幼兔具有很强的致病性,能导致严重的肝球虫病。

斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达

【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。

单核细胞增多性李氏杆菌野毒株InlB的分子特征及其表达和纯化研究

采用PCR技术扩增单核细胞增多性李氏杆菌TA野毒株内化索B（InlB）基因，进行编码分子的序列和结构分析，并克隆人大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。该基因全长1893bp，编码630个氨基酸，其中前35个氨基酸残基构成信号肽序列。在推导的InlB蛋白氨基酸序列中，从N端到C端分别包括1个α-螺旋的Cap结构域、6个富含亮氨酸的重复基序（LRR）、1个免疫球蛋白样结构域（IR）、1段B重复序列和3个串联的GW结构域，同时还存在5个潜在的N-联糖基化位点，Leu占所有氨基酸残基的10．2％。与GenBank已经报道的18个不同流行株InlB基因相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在91．1％～99．6％和92．3％～99，8％之间。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE和Western blot分析证实该基因已经正确表达。用Ni^2＋亲和层析柱纯化了InlB重组蛋白。

新疆部分地区兔球虫种类调查研究

对新疆部分地区家兔球虫的种类进行调查,发现兔的艾美耳球虫检出率为100%,并检出10种兔艾美耳球虫,即斯氏艾美耳球虫(Eimera stiedai)、大型艾美耳球虫(E.magna)、无残艾美耳球虫(E.irrestidua)、梨型艾美耳球虫(E.piriformis)、小型艾美耳球虫(Eexigua)、肠艾美耳球虫(E.intestinalis)、盲肠艾美耳球虫(E.coecicola)、穿孔艾美耳球虫((E.perforans)、野兔艾美耳球虫(E.leporis)、黄艾美耳球虫(E.flsvescens),其中穿孔艾美耳球虫、小型艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫为优势虫种。

斯氏艾美耳球虫孢子生殖及其致病性研究

目的采用单卵囊分离技术分离斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai),观察其卵囊在孢子化过程中的发育形态变化。方法通过人工感染断奶幼兔,以潜伏期、死亡率、肝指数、血清中转氨酶数值、肝脏病变记分等指标研究其致病性。结果采用单卵囊感染技术成功分离了E.stiedai单卵囊,卵囊在29℃条件下最早孢子化形成时间为39 h,潜在期为13～15 d,感染率为20%。结论用继代增殖的纯株E.stiedai人工接种试验兔,在一定范围内其致病性随感染剂量的增加而增强。

兔IFN-γ基因的克隆、遗传进化分析及其表达

运用RT-PCR技术对用ConA刺激后的中国白兔外周血淋巴细胞（PBMCr）进行扩增。将纯化后的PCR产物克隆人pMD18-T中进行序列测定。并进行遗传进化分析．结果发现：该基因全长501bp，编码167个氨基酸．其中前20个氨基酸残基构成信号肽序列．与不同物种IFN-γ基因相比，核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异．在推导的中国白兔IFN-γ氨基酸序列中。在41～43、108～110和117～119位存在3个潜在的N-联糖基化位点，同时存在3个Cys残基．转化重组质粒pETIFN-γ的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为22．6kDa的重组蛋白．经凝胶薄层扫描．重组蛋白表达量可占菌体蛋白的19．2％．

15例成年国人颞骨内部结构CT解剖学

目的:研究成年国人颞骨内部解剖结构的CT重建图像,为临床耳显微外科及神经外科手术提供解剖学依据。方法:15名健康志愿者应用Picker5000螺旋CT机,平行于听眦线扫描,应用VoxelQ工作站进行多层面重建(multi planar reconstruction,MPR),表面遮盖重建(surface shaded display,SSD)及仿真内窥镜成像(CT virtual endoscopy,CTVE),多角度旋转观察颞骨内部解剖结构。结果:MPR能在不同切面显示耳蜗、半规管、内耳道及面神经管垂直段等结构,显示率为100%;SSD能清晰显示颞骨重要的骨性结构,如内耳门、颈静脉孔等,冠状位切割后的SSD图像能生动地显示锤骨、砧骨的立体形态及空间关系;CTVE可模仿内窥镜从外耳向中耳移动,清晰显示骨性外耳道、鼓室内侧壁及听骨链等结构。结论:MPR可行多方位重建,有助于耳颞部病变的全面了解,是轴位CT良好的补充;SSD、CTVE可准确、立体的观察颞骨内部解剖结构,对临床诊断、手术方案的设计、医学教学等具有指导意义。

中国白兔白介素-10基因的克隆、表达及其抗体的制备

目的克隆并表达中国白兔IL-10基因,制备抗IL-10多克隆抗体。方法运用RT-PCR对从ConA诱导后的中国白兔外周血单核细胞(PMBCr)总RNA中扩增IL-10基因,克隆后进行测序和遗传进化分析,同时将其亚克隆pET28a中,在大肠杆菌中诱导表达,并用纯化的表达产物制备多克隆抗体。结果该基因全长537 bp,编码178个氨基酸。与欧洲兔IL-10基因同源性很高,但与鼠、鸡、河豚和斑马鱼等不同物种IL-10基因差异较大。经IPTG诱导后,重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为23.4×103的重组蛋白。Western blot分析表明,中国白兔IL-10基因已经表达。重组表达的蛋白量可占菌体蛋白的15.2%。结论成功实现了中国白兔IL-10的原核表达,制备了小鼠抗兔IL-10的多克隆抗体。

利培酮与氯氮平治疗精神分裂症对心电图的影响

目的 探讨利培酮、氨氮平分别对心电图的影响。方法 对服用利培酮及氯氮平治疗的精神分裂症病人分别定期心电图检查,时间为服药后第12、4、8周。结果 利培酮67次(12.41％),氯氮平363次(59.70％)出现异常,两者有显著性差异(P<0.05)。结论 利培酮对心电图影响显著低于氯氮平。

犬瘟热病毒TN株血凝基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法对分离的TN野毒株H基因进行了扩增 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,进行核苷酸序列测定。结果TN野毒株H基因ORF全长 1 ,81 5bp ,编码 60 4个氨基酸。与GenBank中己报道的 7个CDV毒株相比 ,H基因核苷酸序列的同源性在 92 %～ 99%之间 ,推导的H蛋白氨基酸序列的同源性在 91 %～ 99%之间。TN株H蛋白潜在的N 联糖基化位点为 8个 ,而Onderstepoort弱毒株H蛋白为 4个 ;其中N端第 1 9～ 2 1、 30 9～ 31 1、 5 84～ 5 86位氨基酸所形成的 3个潜在的糖基化位点是野毒株拥有而疫苗株所没有的。预测的TN株和Onderstepoort株H蛋白的疏水性及抗原表位存在一定差异。研究结果提示TN野毒株H蛋白免疫原性可能与弱毒株有较大差别 。

巴楚蘑菇多糖对鸡免疫功能的影响

采用细菌吞噬试验、体内淋巴细胞转化试验、血凝和血凝抑制试验来研究巴楚蘑菇多糖对鸡免疫功能的影响。结果显示:巴楚蘑菇多糖能够提高鸡白细胞的吞噬能力、淋巴细胞的转化率及抗体效价。结论:巴楚蘑菇多糖具有免疫增强作用。