2023年度液体活检标志物研究进展年终盘点

液体活检技术作为新兴的检测技术,涵盖了不同类型的肿瘤相关物质,包括循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞、细胞外囊泡、非编码RNA等,这些物质可以非侵入性地反映体内肿瘤的状态,在肿瘤筛检中具有广阔的应用前景。本文就2023年度液体活检标志物检测及其在肿瘤的早期诊断、疗效评估、预后和复发转移监测等方面研究新进展进行盘点,为深入探索以液体活检标志物为核心的肿瘤个体化诊治策略提供有力依据。

质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用

目的研究质粒载体介导的肿瘤细胞RNA干扰效果.方法构建以H1 RNA为启动子的针对GFP基因不同序列片段的RNAi质粒pLasRiGFP1/2/3.将其与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞或单独转染SPCA1-GFP,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP表达.结果 pLasRiGFP1、pLasRiGFP2和pLasRiGFP3在HEK293中对GFP表达的抑制率分别为97.5%、97%和89%,Hela细胞中为83%、90%和90%,SPCA1细胞中为65%、55%和40%.pLasRiGFP1与pLasRiGFP2在SPCA1-GFP细胞对GFP的抑制率分别为53%和58%.RNAi作用在48～96 h最强,并随RNAi质粒增加抑制效果呈增强趋势,但到达一定量后作用趋势平缓.结论 H1 RNA为启动子的RNAi质粒能有效介导肿瘤细胞RNAi,其作用存在剂量和时间效应,受靶序列、细胞类型等因素的影响.

CA125监测进展期卵巢癌疗效和复发的意义

目的 评估CA12 5监测进展期卵巢癌疗效及复发的应用价值。方法 采用ES3 0 0全自动酶免疫分析系统检测 5 4例Ⅲ、Ⅳ期原发卵巢癌患者、42例综合治疗后随访卵巢癌患者、2 4例治疗后复发或远处转移患者、15例卵巢良性肿瘤和65例健康女性血清CA12 5水平。结果 ( 1) 5 4例进展期原发卵巢癌患者血清CA12 5水平显著高于正常人和卵巢良性肿瘤患者。以 3 5U/ml为限定值 ,卵巢上皮癌 10 0 %阳性 ,非上皮癌中 2例内胚窦瘤为阴性 ,其余均阳性。良性肿瘤 13 .3 %假阳性。Ⅲ、Ⅳ期间无显著差异。 ( 2 )原发卵巢癌患者经综合治疗后 ,CA12 5明显下降 ,病情转归与CA12 5下降的幅度相关 ,但与治疗前水平无关。 ( 3 ) 42例随访未出现复发者 ,10 2次检测CA12 5平均值为 2 7.85± 12 .66U /ml ,连续 2次CA12 5升高者 2例 ,治疗后复发或远处转移者 2 4例 ,CA12 5平均值为 3 3 9.5 5± 2 46.6U/ml,其中 95 .8% ( 2 3 /2 4)高于限定值。CA12 5判断复发的准确率为 95 .4% ( 63 /66)。结论 CA12 5的连续监测可作为进展期卵巢癌疗效评价、复发转移及预后的一个有用指标。

人肺癌细胞株化疗敏感性与基因表达的关系

目的探讨人肺癌细胞株对化疗药物的敏感性与多药耐药相关基因和凋亡调控基因表达的关系。方法采用MTT法检测5株肺癌细胞SPCA1、NCI-H446、SH-77、95C和95D对阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、卡氮芥(BCNU)的敏感性。流式细胞术检测多药耐药基因P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)等耐药相关基因和Fas、bcl-2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果不同肺癌细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析显示,肺癌细胞株对MMC的敏感性与GST-π和bcl-2的表达呈负相关,P值分别为0.040和0.030,GST-π和bcl-2的表达水平较高者,MMC的IC50较高,敏感性较低;对DDP的敏感性与p53蛋白表达水平呈负相关(P=0.036);对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关(P>0.05)。结论人肺癌细胞株对不同化疗药物敏感与否有不同的机制,对MMC的敏感性与GST-π和bcl-2的表达有关,对DDP的敏感性与p53的表达有关。

慢病毒shRNA表达载体介导人肿瘤细胞基因稳定沉默的影响因素

目的:探讨慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰的影响因素。方法:用介导RNAi的慢病毒载体Lenti6-HIF1α和Lenti6-HIF1β分别转导人肿瘤细胞系Hela、SPCA1和A549,筛选靶基因稳定表达沉默的细胞株。病毒RNA分子拷贝数和靶基因mRNA水平用实时定量RT-PCR确定。结果:针对不同靶基因的慢病毒转导肿瘤细胞的效率与靶基因无关、存在细胞类型特异性。8h内病毒转导效率与吸附时间呈正关,12h后继续延长吸附时间不能提高转导效率。对靶基因表达的特异性抑制效果与病毒量呈正相关。靶基因稳定沉默细胞株的RNAi效果与细胞类型无关,与靶细胞基因组整合的shRNA表达结构的拷贝数呈正相关。结论:慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰,短期基因抑制效果取决于细胞类型、病毒量和病毒的吸附时间,稳定基因沉默效果与病毒整合到靶细胞基因组的拷贝数相关,筛选稳定基因沉默细胞株时,应尽可能提高病毒量以提高病毒整合的拷贝数。

骨软组织肉瘤中耐药相关蛋白表达及与化疗耐药的相关性

目的:探讨4种耐药相关蛋白-P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)和多药耐药相关蛋白(MRP)在骨肉瘤细胞株Saos2和U2OS以及34例骨软组织肉瘤的表达及与化疗耐药的关系。方法:应用流式细胞术(FCM)检测蛋白表达;MTT法评估化疗耐药。结果:Saos2细胞耐药相关蛋白的表达低于U2OS,阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素(MMC)、氮烯咪胺(DTIC)和长春新碱(VCR)的敏感性高于U2OS。两细胞株经1/5半数抑制浓度(IC50)的ADM和DDP分别处理24 h后,GST-π增幅达33%-43%。34例患者对ADM、DDP、5-Fu、MMC、DTIC、VCR和MTX的不敏感率分别为41.18%、17.65%、47.06%、50.00%、76.47%、61.76%和52.94%。肿瘤组织P-gp、GST-π、LRP和MRP表达分别为1.54、2.58、1.91和1.86。相关分析显示,P-gp表达与ADM耐药呈正相关(r=0.485,P<0.01),GST-π表达与ADM、DDP、5-Fu、MMC耐药呈正相关(r分别为0.402、0.458、0.364和0.500,P值分别为<0.05、<0.01、<0.05和<0.01)。耐药相关蛋白在不同性别、不同年龄、不同病理类型、不同肿瘤大小患者间的表达差异均无显著(P>0.05)。经术前化疗的患者GST-π表达显著升高,且随访复发患者术前GST-π表达显著高于无复发患者(P<0.05)。结论:骨软组织肉瘤患者耐药相关蛋白表达及化疗敏感性存在显著个体差异。化疗可引起GST-π表达上调。原发GST-π高表达是骨软组织肉瘤耐药的主要机制并与预后有关。

18种人肿瘤细胞株药物敏感性与基因表达的关系

目的探讨18种人肿瘤细胞对化疗药物的敏感性与基因表达的关系。方法采用MTT法检测细胞株对阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)和卡氮芥(BCNU)的敏感性。流式细胞术检测P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)等耐药相关基因和Fas、bcl-2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果不同细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析表明,细胞株对DDP的敏感性与p53表达呈负相关(P=0.041),对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关(P>0.05)。结论细胞株对DDP的敏感性与p53表达有关。

几种常见恶性肿瘤与ABO血型的关系

几种常见恶性肿瘤与ＡＢＯ血型的关系山东省肿瘤防治研究院（２５０１１７）宋现让，刘美琴，韩兰元，董秀梅，王克淳我院１９９４～１９９５年的外科手术病例中，经术后病理确诊且有血型记载的共１３３７例。其中男７３１例，女６０６例，包括食管癌、胃癌、乳腺癌、肝癌...

人HIF-1α基因RNAi重组腺病毒的构建及对人肺腺癌SPCA-1细胞HIF-1α表达的影响

目的构建人HIF-1α基因RNAi重组腺病毒Ad.HIF-1α,并观察其对人肺腺癌细胞SPCA-1的影响。方法采用酶切、连接、转化等方法,利用AdEasy系统构建插入HIF-1αRNAi片段的重组腺病毒Ad.HIF-1α。氯化铯梯度离心法纯化病毒。病毒功能滴度采用传导293细胞的方法,以2MOIAd.HIF1α传导SPCA-1细胞,48h后应用流式细胞术检测绿色荧光蛋白(GFP)表达和HIF-1α蛋白表达。HIF-1αmRNA表达用荧光定量PCR检测。结果酶切和卡那霉素抗性筛选证实,重组穿梭载体pAdTrack.HIF-1α和腺病毒质粒pAd.HIF-1α均构建正确。pAd.HIF-1α导入293细胞3d,约15%的细胞表达GFP,最终所获病毒滴度为5.0×1010TU/mL。Ad.HIF-1α转导SPCA-1细胞48h,GFP表达率为92%;HIF-1αmRNA和蛋白表达分别下降89%和87%。结论成功构建人HIF-1α基因RNAi腺病毒,为通过阻断HIF-1α基因治疗肺癌提供初步实验依据。

致敏树突状细胞活化细胞毒性T细胞抗肿瘤作用的研究

目的研究树突状细胞(DCs)激活的细胞毒性T细胞的抗肿瘤及预防肿瘤发生的作用。方法细胞因子诱生人PBMC未成熟DCs,加入肿瘤细胞抗原提取物致敏DCs产生成熟DCs;通过细胞形态、表面标记鉴定成熟DCs,MTT法测成熟DCs活化的细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性;裸鼠体内注射活化CTL观察其抑制移植瘤生长及发生的作用。结果经过7d培养,获得大量形态典型、具有强烈刺激增殖能力、高表达CD80(63.5%)、CD83(67.6%)和CD3/HLA-DR(83.2%)的DCs。其活化的CTL在20∶1效靶比时对抗原来源细胞株自身的杀伤率达75%以上,对同系细胞株的杀伤活性为35%-45%,对其它种系肿瘤细胞仅有微弱杀伤力(P<0.01)。CTL对裸鼠结肠癌HT-29移植瘤有特异性的生长抑制和预防生成作用(P<0.05)。CTL治疗组肿瘤组织中PCNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论肿瘤细胞抗原活化的DC诱导CTL对肿瘤有特异性的杀伤作用,体内应用可特异性抑制移植结肠癌的生长或预防小鼠结肠癌移植瘤的发生。

乏氧诱导因子-1α基因沉默对肺癌细胞乏氧应答相关基因表达的影响

乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)是肿瘤细胞适应乏氧微环境的关键调控因子,具有作为治疗靶基因的潜力,以克服乏氧诱导的治疗抗拒等效应.下调其表达可能影响肿瘤细胞内一系列乏氧应答相关基因的表达.本研究采用已构建的HIF-1αRNAi慢病毒载体转导肺腺癌A549细胞,经杀稻瘟素(blasticidin)筛选建立HIF-1α基因稳定沉默的A549细胞株.应用cDNA微阵列技术检测并比较HIF-1α基因沉默A549细胞株和其亲本细胞株在常氧和乏氧状态下的基因表达谱改变.应用定量RT-PCR方法验证部分cDNA芯片差异表达基因的表达改变.HIF-1α基因稳定沉默细胞株A549/HIF-1α(-),在常氧和乏氧条件下HIF-1α mRNA水平分别较A549细胞下降89.2%和88.1%,HIF-1α蛋白水平分别下降97.2%和88.4%.在乏氧条件下,cDNA微阵列检测的1280个基因中,52个基因表达上调,15个基因表达下调.HIF-1α基因沉默显著影响其中27个基因的乏氧诱导效应.定量RT-PCR验证其中ENO2、BCL-2、CXCR4和MMP11的表达水平,与cDNA芯片结果相符合.结果提示,HIF-1α基因沉默能够在一定程度上阻断肺癌细胞的乏氧应答,在克服乏氧导致的肺癌治疗抗拒方面具有潜力.

等位基因3′末端碱基特异性引物定量PCR检测人脂联素基因单核苷酸多态性

目的建立非探针标记荧光定量PCR的SNP检测技术,分析人脂联素(APM1)基因单核苷酸多态性(SNP)与Ⅱ型糖尿病(T2DM)的关系。方法设计3′末端碱基特异性引物,进行定量PCR反应,通过比较各对引物的扩增效率判断基因型,并进行测序验证。利用该方法确定20例T2DM、24例肥胖及28例同年龄组正常人APM1基因的45位和276位碱基的SNP。结果该方法能有效地区分不同的基因型,与测序结果符合率100%。APM1基因45位SNP与T2DM相关(P<0.05),基因型为TT纯合子者发生T2DM的危险性是G/T和GG者的3倍;而肥胖与APM1基因45和276位点SNP无关。结论等位基因3′末端碱基特异性引物定量PCR可以用于基因SNP检测。APM1基因45位碱基的SNP与T2DM发生有关。

卵巢癌血清标志物研究进展

CA12 5是卵巢癌最好的标记物 ,在早期诊断、治疗监测、复发、预后等方面有较大价值。OVX1、CA5 4/ 6 1、M CSF等标记物与CA12 5有互补性 ,联合应用可提高灵敏度和特异性。

造血干细胞诱导树突状细胞的临床应用

目的:探讨回输自动员人外周造血干细胞(PBSC)体外诱导树突状细胞(DCs)治疗乳腺癌患者的可行性。方法:采用CS-3000血细胞分离系统分离9例粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预动员乳腺癌患者PBSC,在体外经rhGM-CSF、rhIL-4诱导和自体肿瘤细胞提取物刺激后成为成熟DCs,收集并自体回输。用MTT法测定DCs在体内外激活细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性。结果:9例患者平均采集1.02×109PBSC,培养后平均收获2.3×108DCs,CD83表达率平均为68.7%。收获DCs的数量是等量未动员全血的57.5倍。在体外自体肿瘤抗原致敏的DCs激活CTL对自体原代培养的肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。DC瘤苗自体回输除轻微发烧外,无任何其它不良反应,回输后患者PBMC对自体肿瘤细胞的杀伤活性提高20倍。结论:用血细胞分离机分离G-CSF动员肿瘤患者PBSC,在体外诱导制备自体DC瘤苗,回输治疗可提高对自体肿瘤细胞的杀伤活性,而且安全可靠,无明显不良反应。

宫颈粘液癌胚抗原含量与宫颈癌的关系初探

本文检测了３０例子宫颈癌患者和１７例宫颈粘液增多的妇科良性疾病患者的宫颈粘液和血清中癌胚抗原（ＣＥＡ）的含量，结果表明，血清ＣＥＡ水平与宫颈粘液ＣＥＡ水平成正相关（ｒ＝０．５３５，ｐ＜０．００５），宫颈癌患者血清和宫颈粘液中ＣＥＡ含量均高于良性妇科疾病患者（Ｐ＜０．０５和ｐ＜０．００１）。宫颈粘液ＣＥＡ测定比血清ＣＥＡ测定更有临床价值，特别是对宫颈癌的早期诊断。

载体介导的哺乳动物细胞RNA干扰技术与基因治疗

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物在进化过程中,抵御病毒感染及由重复序列和突变引起基因组不稳定 性的保护机制。RNAi是由双链RNA引发的靶基因mRNA降解而导致基因转录后沉默的现象,研究者利用这一现象对要研 究的基因进行抑制,从而形成了RNAi技术。RNAi具有特异高效的特点,因此该技术已在研究基因功能和进行基因治疗中得 到广泛应用。RNAi的实现途径有多种,每种方式都各有优缺点。

体液肿瘤标记物的临床应用

实验室检查已成为肿瘤临床重要的检查手段,体液肿瘤标记物作为肿瘤诊断、监测复发、判断疗效和预后方面的重要指标,其合理应用尤其重要.综述肿瘤标记物的选择、联合和分析原则以及国内外的发展动态.