阪崎肠杆菌单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

试验旨在制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,初步建立其ELISA检测方法。以灭活的阪崎肠杆菌全菌体为抗原免疫BALB/c小鼠,筛选血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞,并用间接ELISA法选取阳性杂交瘤细胞,扩大培养后测定单克隆抗体的效价,进行特异性及抗体间的配对,使用mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,并利用得到的抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。本试验得到3株具有良好特异性能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株5C10、2B6和Ab02,经两两配对,据阳性D450nm值及P/N值选择1∶20000稀释的5C10作为包被抗体,1∶40000稀释的Ab02作为酶标二抗,建立ELISA检测法,应用建立的方法与荧光定量PCR方法检测动物实验室保存的20份进出口送检奶粉样品,结果显示试验结果一致。本试验成功制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体并建立其ELISA检测法,为大批量快速检测阪崎杆菌奠定了基础。

双重实时荧光PCR定量检测动物产品中牛源性成分

旨在建立一种定量检测动物产品中牛源性成分含量的双重实时荧光PCR方法。以牛卫星IV DNA为检测靶基因,以肌肉生长抑制素基因作为内对照合成引物探针,采用基于TaqMan的双重实时荧光PCR技术对已知牛肉添加比例的冻干混合肉粉标准品进行检测并建立线性模型,并应用模拟样品和送检样品进行了验证检测。结果显示,该方法可检出牛源成分含量为0.1%的冻干肉粉,不与其他种动物组织发生交叉反应,重复性试验的相对标准偏差小于5%,方法的扩增效率为93.6%。该方法适用于肉品中牛源性成分的定量检测,可用于测定市场上动物产品中的牛源性成分含量。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型RT-LAMP检测方法建立

本研究针对猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型ORF6基因的6个区域,利用2对引物建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP快速检测方法,该方法具有高灵敏度,高特异性的优点,在2小时左右即可得出结果,其灵敏度与PRRSV荧光RT-PCR检测方法相近,高于普通RT-PCR检测方法。将灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型培养物作10倍系列稀释,结果显示建立的荧光RT-PCR的检测极限可达10-7,RT-PCR检测方法的检测极限为10-5,RT-LAMP检测方法达到10-8,表明建立的RT-LAMP检测方法非常灵敏,可用于检测猪组织样本中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。

进境蓝舌病抗体阳性动物带毒分析及检疫处理研究

为评估进口蓝舌病病毒(BTV)抗体阳性动物的感染状态,分析其带毒风险,对从国外进口的9批19714头动物,无菌采集全血分离血清,采用竞争ELISA方法检测BTV抗体。对BTV抗体检测阳性的动物,采集抗凝血,采用OIE推荐的套式RT-PCR和荧光RT-PCR方法进行检测,同时将样品送往蓝舌病参考实验室进行病毒分离鉴定,以确定动物的蓝舌病感染状态。结果 9批动物中检出28头BTV抗体阳性动物,但核酸检测和病毒分离鉴定的结果均表明这些BTV抗体阳性动物并不携带有非感染性和感染性病毒粒子。结合9个批次的进口动物并无明显临床表现,且进口动物来源地也无蓝舌病(BT)的疫情发生,据此根据OIE《陆生动物卫生法典》条款,判定这些抗体阳性动物为带毒阴性。本研究通过对BTV抗体阳性动物的带毒分析,并结合OIE确定BTV感染的要求,对BTV口岸隔离检疫流程提出建议,以指导动物检疫工作,阻止病原经口岸传入。

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID_(50)/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。

国礼动物变化趋势及检疫监管

为了解国礼动物发展现状,给优化检疫管理政策提供支持,本文梳理了自1949年以来我国接收国礼动物和作为国礼走出国门的年代、动物物种及赠送和受赠国家等情况,阐述了动物作为国礼的原因、变化趋势,分析了其在政治、运输饲养、疫病传播等方面存在的风险,提出了通过部门协作、通关运输、隔离检疫、饲养与治疗、防疫消毒、信息沟通、应急处置等措施,来提升对国礼动物监管水平的建议。

高通量测序技术在动物MicroRNA研究中的应用

简述了动物MicroRNA的发生、作用机制和近几年高通量测序技术在动物MicroRNA研究中的应用进展。

伪狂犬病病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用

能力验证样品的制备是实验室病原核酸检测能力验证的难点和核心内容,本研究以伪狂犬病病毒南阳株细胞培养物为材料,通过高温处理的方式灭活病毒,研制了伪狂犬病病毒核酸检测的能力验证样品,经均匀性和稳定性检验证实样品达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。利用能力验证样品,设计和实施了"BIQTC-2013-01《猪伪狂犬病病毒核酸检测》能力验证计划",共有7家实验室参试,验证满意率达100%。伪狂犬病病毒核酸检测能力验证样品的研制和在能力验证计划中的应用,为评估我国各级实验室伪狂犬病病毒核酸检测的能力提供了较有价值的借鉴和参考。

三种猪病相关microRNAs的研究

本实验旨在探索繁殖与呼吸综合征(PRRS)、口蹄疫(FMD)和传染病胃肠炎(TGE)感染猪的micro RNA(mi RNA)变化,为疫病监测提供新途径。采用生物信息学方法预测可能的相关病毒mi RNA,在MARC-145细胞系中转染10种mi RNA mimic和inhibitor。相关实验结果发现过表达mi R-125b、mi R-147和mi R-181降低了PRRSV的繁殖,而敲低mi R-125b、mi R-147和mi R-181能促进PRRSV复制;感染猪口蹄病毒的样本中let-7a表达量明显上升,而mi R-146b表达量明显下降;对照组中mi R-142的表达量高于患有传染性胃肠炎样品。说明相关micro RNAs可能参与病毒调控,可用作检测参考指标。

猪繁殖与呼吸综合征LAMP检测方法建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因为靶基因,设计2对引物,建立PRRSV RT-LAMP检测方法。该检测方法的灵敏度与荧光RT-PCR检测方法相近,高于普通RT-PCR检测方法,约2 h即可得出结果,不需要昂贵的仪器设备,适于猪场PRRSV的监测。

我国检疫犬应用现状

介绍了检疫犬的应用背景及在国内的发展,并对检疫犬的挑选、训练情况、应用及其对我国检验检疫事业发展所做的贡献进行了综述。

实验室质量控制关键要素管理系统的建立与运行

利用RFID等现代信息化技术,以"人、机、样、法、溯"为关键要素,建立人员、设备、样品、方法、试剂等数据库,开发相应管理和溯源软件,搭建动物检疫实验室质量控制关键要素管理系统并运行,提高实验室管理工作效率并有效地节约成本。本文阐述了系统核心技术的实现方法。

国礼动物检疫分析

本文收集列举了新中国成立以来我国接收的国礼动物和作为国礼走出国门的动物情况,分析了动物作为国礼的原因、变化趋势和潜在的风险,提出了国礼动物的检疫监管建议,为国礼动物检验检疫监管提供基础。

沙门氏菌LAMP可视化检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速现场检测,根据沙门氏菌invA基因编码区序列,设计合成1套引物,通过对反应物浓度和反应条件优化,建立了沙门氏菌属特异性LAMP检测方法;通过对invA基因8个区域的6条引物配对进行等温扩增,并在反应体系中加入HNB来指示反应结果,实现了反应的快速闭管检测。灵敏度试验显示,建立的方法可以检出稀释至3.6×10~1 CFU/mL菌液所提取的DNA;特异性试验显示,建立的方法与大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA、布鲁氏菌试管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA以及猪链球菌2型DNA不发生交叉反应,但能检出鸡白痢、禽伤寒沙门氏菌凝集抗原以及马流产试管凝集抗原提取的DNA;重复性试验显示,3个稀释度菌液DNA的3次重复检测均为阳性;应用试验显示,从经增菌培养的200份进境猴粪拭子样品中检出阳性2份,与细菌分离鉴定检测结果一致。结果表明,所建立的方法敏感性和特异性较高,重复性满足实际要求,可用于进境动物样品的沙门氏菌检测。

蓝舌病病毒核酸标准样品的制备及荧光定量RT-PCR方法的研究

为制备蓝舌病病毒(BTV)NS3基因标准样品并建立BTV通用型荧光定量RT-PCR检测方法,本研究首先从BTV-1型核酸中扩增完整的NS3基因,经克隆测序后,采用体外转录方法制备其cRNA。使用RNA保存液稀释至含量约10~8拷贝/μL,分装后进行均匀度和稳定性检验,并通过联合定值确定标准样品的量值。结果表明,BTV NS3标准样品的瓶间差异<5%,均匀度和稳定性良好;定值结果为(1.032±0.02)×10~8拷贝/μL。此外,使用该BTV标准样品作为模板,通过优化反应体系和条件,建立了BTV通用型荧光定量RT-PCR快速检测方法,并评价其特异性和敏感性。结果显示,该方法能够对目前流行的26个血清型的BTV核酸检测均为阳性,而与其它相关的反刍动物病毒均无交叉反应,特异性良好,且最低可检测到10拷贝/μL病毒核酸。采用建立的BTV荧光定量RT-PCR方法对送检的临床样品进行检测,并与国家标准规定的套式RT-PCR方法进行比较,结果表明两种方法一致性很高,但荧光定量RT-PCR方法操作更为简便,结果准确,更适用于大量临床样品的检测。

马梨形虫病病原双重荧光PCR快速检测方法的建立与应用

在序列比对分析的基础上,设计2对引物和2条MGB探针,经体系优化建立了可快速鉴别检测两种马梨形虫病病原(马泰勒虫和驽巴贝斯虫)的双重荧光PCR检测方法。该方法可分别检出22和31基因拷贝的虫体DNA,且不与其他马病病原发生交叉反应。应用建立的荧光PCR检测方法,对采自进出口马匹的10份马全血和20份马血清进行检测,结果从马全血中检出2份马泰勒虫阳性样品。使用一对马泰勒虫EMA1全基因扩增引物,从2份阳性样品中扩增了EMA1基因。克隆测序后,对该基因全序列进行分析,证实其为马泰勒虫特异基因序列;2份样品的基因序列相似性为98.9%,存在6个氨基酸变异;2个样品中的EMA1基因不完全一致,表明2个感染样品中的虫体可能为不同的马泰勒虫虫株。

金鱼造血器官坏死病传入风险评估

为评估鲤科疱疹病毒-2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)随水生动物及产品跨境传入风险,按照OIE传入风险评估框架,从危害识别、风险评估及风险管理3个方面,开展了CyHV-2跨境传入风险分析,并提出了相应的风险控制措施。分析认为:养殖用活易感鱼类的风险预测为高,而食用的、冰冻和冰鲜的以及用做饵料的易感鱼类风险预测为中,易感鱼类加工后的产品、非易感鱼类及运输活鱼的水、包装、工具等风险预测为低。建议对进口的活易感鱼类(金鱼、鲫鱼及其普通变种),严格采取相应的风险管理措施;对食用的、冰冻和冰鲜的易感鱼类避免从疫区进口,用做饵料的易感鱼类改用经过加工处理后的野杂鱼;而加工后的鱼制品及非易感鱼类,可允许自由贸易;对运输活鱼的水、包装等进行强制常规消毒。

病死猪圆环病毒2型检测及全基因序列分析

为准确检测猪圆环病毒2型(PCV2)并分析其基因序列情况,在序列比对分析的基础上,设计一对简并引物和一条探针,经体系优化建立了PCV2的荧光PCR方法。该方法可检出10拷贝的PCV2质粒DNA,不与猪瘟病毒等多种病毒发生交叉反应。对送检的2批次45份病死猪脏器进行检测,检出25份阳性样品,与套式PCR方法的复合率为95.6%;对3份强阳性样品使用一对全基因组扩增引物,扩增了PCV2型全基因片段;经克隆测序后分析,发现3个病毒基因分别属于2种基因亚型(PCV2b和PCV2d)。本研究对于PCV2的准确检测及其变异特征的了解具有参考意义。

口岸截获猪肉肠的主要猪病病原核酸检测

为了解非法跨境携带猪肉肠传播动物疫病的风险,对北京口岸截获的猪肉肠进行8种猪病病原核酸的检测分析。结果显示:282份样品中,猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)以及猪细环病毒1型(TTSuV1)均有检出;除PRV阳性率较低外(3.9%),其余3种阳性率较高,均大于35%。这表明口岸非法携带猪肉肠存在传播多种动物疫病的风险,提示相关执法部门应强化口岸动物检疫,降低疫病传入风险。

内含猪繁殖与呼吸综合征病毒保守基因序列假病毒粒子的构建及应用

为构建内含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守基因序列的假病毒粒子,将MS2噬菌体基因组中5′非编码区、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列克隆于原核表达载体pET32a,在其下游插入PRRSV ORF7和3′非编码区保守序列,获得重组表达载体pET-MS2-PRRSV。将重组质粒pET-MS2-PRRSV转化表达菌株BL21(DE3),经诱导表达、纯化,获得高纯度的病毒样颗粒。病毒样颗粒经RT-PCR和PCR鉴定含有PRRSV ORF7和3′非编码区RNA且没有质粒DNA残留,并能耐受RNase降解。采用荧光定量RT-PCR对病毒样颗粒定值后,制备了用于PRRSV核酸检测的标准品,该标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为PRRSV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。