结核分枝杆菌培养物不同组份蛋白质组研究

将结核分枝杆菌H3 7RV株在苏通培养基内 ,3 7℃培养 2 1d ,然后将培养物分成上清液(A)、细胞浆 (B)和细胞膜 (C)蛋白质样品。以pH3 0～ 1 0 0的IPG预制胶条等电聚焦电泳为第一向 ,SDS PAGE为第二向进行双向电泳 (2 DE)、银染。经扫描、计算机处理。A组份的部分蛋白质斑点采用质谱仪进行蛋白质鉴定。A、B和C 3个组份蛋白质斑点总数分别为 90 7、884和 6 81 ;3个组份蛋白质分子量分布基本相似 ,约 70 5 %～ 74 4%在 1 0～ 49kD之间 ;蛋白质等电点 (pH)A、B两组份分布基本相似 ,约 80 9%～ 83 5 %在pH3 0～ 6 4之间 ,而C组份pH7 6～ 1 0 0之间的蛋白质斑点数比A和B两组分略多 ;A、B和C 3个组份表达丰度较高的蛋白质斑点数占各组蛋白质斑点总数的比例分别为 7 8%、2 7 4%和 2 8% ,蛋白质等电点90 0 %均分布在pH3 0～ 6 4范围内。B组份蛋白质分子质量 73 1 %分布在 1 0～ 49kD之间 ,比A、B两组份略高。A组份 1 4个蛋白质斑点经肽质量指纹谱分析 ,其中 ,9个点有同源性的或推测的蛋白质功能 ,5个蛋白质功能不清楚。总之 ,初步获得了结核分枝杆菌H3 7RV株在上述体外培养条件下收获的培养物的上清液、细胞浆、细胞膜蛋白质组 2 DE图谱及其特点 。

母牛分枝杆菌制剂在结核病免疫治疗与预防应用的研究进展

母牛分枝杆菌制剂在结核病免疫治疗与预防应用的研究进展庄玉辉，李国利（解放军三○九医院，北京１０００９１）王国治（中国药品生物制品检定所，北京１０００５０）１９６４年，Ｂｏｎｌｃｋｅ等￣［１］首次报道从牛乳腺分离出母牛分枝杆菌，１９６８年，Ｔｓｕｋａｍ...

母牛分枝杆菌制剂对T淋巴细胞增殖反应影响的研究

以氚标记胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入法检测每分钟脉冲数（ＣＰＭ），比较母牛分枝杆菌活菌悬液、辐射杀死菌悬液及高温杀死菌悬液对健康人外周血Ｔ淋巴细胞增殖反应的影响。以此作为评价治疗以细胞介导免疫为主的结核病免疫功能障碍免疫制剂效力的一个重要参数。在加入单一刺激因子实验中，对照组ＣＰＭ为４４８±１３１；加入ＢＣＧ、母牛分枝杆菌活菌悬液。

抗酸菌L型(变异)分离培养方法的研究

本文介绍用过滤法和酸碱中和离心法前处理痰标本,在胰胨大豆蛋白胨0.25%琼脂培养基(TSA-L)上,34例肺结核病人L型的阳性率分别为20.6%,14.7%,经统计处理,二者差异不显著(P>0.05);在TSA-L斜面上培养,分别是17.6%,14.7%,二法差异也不显著(P>0.05)。77例杆菌型培养阴性的肺结核病人L型阳性率为18.2%。除酸碱中和离心法用TSA-L半流体培养基污染率高外,其它方法均可用于痰标本L型的分离培养。

抗酸分枝杆菌和相关菌全细胞枝菌酸甲基酯的薄层分析

用单向薄层层析方法对22种抗酸分枝杆菌及相关细菌的全细胞枝菌酸甲基酯进行了分析。结果表明,人型结核杆菌、牛型结核杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌和胃分枝杆菌的图谱特征相似,由α、甲氧基和酮基枝菌酸酯组成,还有两种未知成分I和J。微黄分枝杆菌、草分枝杆菌、岛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蛙分枝杆菌和不产色分枝杆菌等均由带α、酮基和蜡脂枝菌酸组成。其它菌种的层析图谱各不相同。诺卡氏菌、红球菌和棒杆菌的图谱较分枝杆菌属简单,主要含有α枝菌酸,又因其Rf值不同,可以将这4种菌属区别开。从肺结核患者痰中分离出来的9株标本枝菌酸图谱与标准人型结核杆菌相同,这和用标准化规程进行鉴定的结果一致。我们认为单向薄层层析对于抗酸分枝杆菌的分类和鉴定具有一定的意义。

聚合酶链式反应检测结核杆菌的研究

以人型结核杆菌基因组 DNA 为模板,合成二段引物各20个碱基进行聚合酶链式反应(PCR)。经琼脂糖凝胶电泳证实,获得一条245bp 扩增带。PCR 检测的敏感性染色体基因组DNA 为1pg,菌悬液为13个活菌/ml。在特异性试验中,人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG可见此扩增带。被试的其它14种抗酸菌以及变铅青链霉菌、大肠杆菌质粒 PUC19、星状诺卡氏菌、红球菌均未见该扩增带。54例肺结核痰标本3种方法检查的阳性率分别为:萋尼氏抗酸染色16.7%,培养法14.8%,PCR 37.0%。前2种检查方法分别与 PCR 比较,经统计学处理均有显著性差异(P<0.01)。12例非结核性肺部疾患痰标本抗酸染色和 PCR 均为阴性。结果表明,PCR 技术是快速、敏感、特异诊断结核病的方法。

结核杆菌的实验室检查

抗酸分枝杆菌有近百种,其中对人和动物致病性最强的是结核杆菌和麻风分枝杆菌,而人型结核杆菌约占90％。结核杆菌的检出和鉴定对结核病具有确诊意义。1 涂片镜检法和分离培养法1.1 涂片镜检法 常用改良萋尔-纳尔逊抗酸染色法。抗酸杆菌呈红色杆菌(或变异形态)。油镜下,若300视野未发现抗酸杆菌,报告“未发现抗酸杆菌”;300视野发现抗酸杆菌1～2条为可疑,报告抗酸杆菌菌数;

BCG基因的克隆与表达

本文应用变铅青链霉菌质粒PIJ486和宿主TK64系统,研究BCG DNA的克隆与表达。重组体的转化率为23.5％。提取85个阳性克隆质粒DNA,经电泳证明均插入BCG DNA片断,任选其中8个质粒DNA经BglⅡ酶切,插入片断大小平均3.43(1.99～4.70)kb。一个阳性克隆株S_(20)的表达产物为分子量16KD_a的细胞内蛋白质抗原。它与人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG抗体呈阳性反应,斑点免疫试验特异性比PPD强。这一结果为进一步研究结核杆菌基因工程技术、研制更有效的结核病诊断、治疗、预防制剂提供了条件。

重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

母牛分支杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生过氧化氢水平的影响

用不同剂量的母牛分支杆菌制剂免疫BALB/c小鼠,检测小鼠腹腔巨噬细胞产生过氧化氢(H_2O_2)的水平,结果显示受免疫小鼠腹腔巨噬细胞产生H_2O_2水平明显高于未免疫小鼠(P<0.01)。不同剂量母牛分支杆菌制剂免疫的BALB/c小鼠,腹腔巨噬细胞产生的H_2O_2水平差异不显著(P>O.1)。认为,母牛分支杆菌制剂作为结核病免疫治疗剂,其作用之一是活化巨噬细胞产生H_2O_2,从而达到杀菌目的。

母牛分支杆菌制剂对免疫功能低下小白鼠的免疫调节作用

不同剂量的母牛分支杆菌制剂应用于免疫功能低下的小鼠模型,检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率。吞噬指数及脾淋巴细胞增殖率。结果显示注射不同剂量的母牛分支杆菌制剂小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数明显高于未注射该制剂对照组(P<0.01),淋巴细胞增殖率也明显高于对照组(P<0.01或 P<0.05)。提示母牛分支杆菌制剂能明显激活巨噬细胞免疫功能,对脾淋巴细胞增殖有明显刺激作用,对调节及提高机体免疫应答水平是有益的,将其应用于结核病免疫治疗,是一种有前景的结核病免疫治疗制剂。

结核病实验室检查技术的研究进展

近年来,分子生物学基因诊断技术及其他新技术引入临床实验室,使结核病病原学诊断等进入了一个崭新的阶段。目前,我国在这方面的研究工作方兴未艾。本文就结核病实验室检查的几项新技术作一介绍。聚合酶链式反应脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶链式反应(PCR)又称DNA体外扩增技术。

结核分枝杆菌katG和inhA基因突变的研究

为了解结核分枝杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列的突变情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＰＣＲ－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法对６２株结核分枝杆菌临床分离株的ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列进行分析。ＰＣＲ分析结果显示：ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列的敏感性为１～１０ｐｇＤＮＡ；其引物ＰＣＲ扩增都具有较高的特异性。以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，１３株敏感株中，１２株ｋａｔＧ基因扩增产物ＳＳＣＰ泳动正常，１株ｋａｔＧ异常；２４株耐非ＩＮＨ抗结核药物株中，８株ｋａｔＧＳＳＣＰ异常；上述２７株的ｉｎｈＡ调节序列ＳＳＣＰ均泳动正常。２５株耐ＩＮＨ株中，３株ｋａｔＧ基因ＰＣＲ扩增阴性，２２株ｋａｔＧ扩增阳性，其中１６株ＳＳＣＰ泳动异常；４株ｉｎｈＡ调节序列ＳＳＣＰ泳动异常，其ｋａｔＧ基因ＳＳＣＰ也异常。结果表明，某些结核分枝杆菌ＩＮＨ耐药性可能是由于其ｋａｔＧ基因完全缺失、ｋａｔＧ基因或ｉｎｈＡ调节序列突变所致，但某些菌株也可能与其无关，是其它耐药基因所致或存在多种机制，尚需进一步探讨。

母牛分枝杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮水平的影响

母牛分枝杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮水平的影响李晓明，庄玉辉，李国利，张小刚（解放军结核病研究中心，北京１０００９１）王国治，赵桂芳，刘勇，沈小兵（中国药品生物制品检定所，北京１０００５０）母牛分枝杆菌（Ｍｙｃｂｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖａｃ...

结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体。结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD。经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上。Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清。结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌。纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值。

金免疫斑点渗滤试验快速检测抗结核抗体对结核病诊断的价值

金免疫斑点渗滤试验快速检测抗结核抗体对结核病诊断的价值李晓明，庄玉辉，王巍，张敦熔肺结核的诊断主要依据临床、胸部Ｘ线表现及痰细菌学检查。痰涂片抗酸染色阳性率较低；细菌培养虽可提高检出率，但亦不足５０％，需６～８周才能报告结果，不能满足临床的需要。ＢＡ...

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的 了解DNA序列分析与PCR -SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR -SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 2 5株、耐药株 4 1株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 2 5株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变 ,4 1株耐利福平株中 38株发生突变 ,突变率为 92 .7% (38/ 4 1) ;2 5株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR -SSCP带型与对照H37Rv株相同 ,4 1株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株 ,提示有突变存在。与DNA序列分析相比 ,PCR -SSCP检测准确率为 93.9% (6 2 / 6 6 ) ,敏感度为 92 .1% (35 / 38) ;特异度是 96 .4 % (2 7/ 2 8)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值 ;PCR -SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。

结核杆菌HSP65 DNA疫苗的初步研究

目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65 000 u基因为基础的核酸 疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后， 插入真核表达载体pcDNA3.1(-) 的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果 重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产 生特异性抗体。结论以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功,并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治中的作用 奠定了基础。

人型结核杆菌全染色体DNA探针鉴别结核杆菌和其它分枝杆菌的研究

诊断结核病和其他分枝杆菌病的许多细菌免疫学传统方法敏感性低,而且烦琐费时。随着分子生物学和基因工程技术的发展,DNA 探针已成为结核病快速诊断和分枝杆菌分类、鉴定的一种敏感方法。目前全染色体 DNA 探针已能够鉴别非同源性和同源性低的菌种。本文介绍在不同杂交温度下应用 DNA 斑点杂交技术鉴别人型结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

支气管肺泡灌洗液检查对痰涂阴肺结核的诊断价值

本文报告对痰涂阴肺结核患者纤维支气管镜刷检、活检、支气管肺泡灌洗液细菌学检查和术后痰涂片镜检结果。ＢＡＬＦ涂片辅以术后痰涂片检出率达３２．７％，简单、快速。根据镜下所见采用不同的取材方法可望提高诊断率。指出常规痰涂片抗酸杆菌阴性的肺结核病人并非均为不排菌者，部份病人仍需积极治疗。