基因工程综合性教学实验系统的开发与应用

本文介绍一种基因工程大型综合性教学实验系统的开发和应用。该实验系统由16个单元操作组成,以大肠杆菌染色体DNA为起始材料,最终获得纯净的重组碱性磷酸单酯酶基因工程产物。各单元操作均设有“建议模式”,但鼓励学生在实验条件允许的范围内自行创新设计实验操作流程。同时,还建立了相应的实验评价系统。

林可链霉菌转化系统的建立

利用基因工程技术改良抗生素生产菌有着广阔的应用前景［１］。值得尝试的是将抗生素生物合成基因片段随机或定向组合导入生产菌中，通过同源重组方式提高生物合成途径中限速步骤相关基因的剂量，以达到提高生产菌发酵单位的目的。此战略被作者称为“基因回转化技术”，并...

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA，呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库，从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2，并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架，其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外，林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源，分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明，melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因，构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519，并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素，而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。

林可霉素生物合成研究进展

迄今,放线菌共分为八大家族,大约四十个属,它们的形态学、趋向性及遗传性状各不相同.原核生物链霉菌是放线菌目中一个具有重要意义的属,在生长期结束后链霉菌常会合成种类繁多的次级代谢产物.除了色素和气味物质外尚有抗病毒剂、抗生素以及细胞刺激物,这些物质在医药、畜牧及农业中都具有重大应用价值.商业化的抗生素中75%是由链霉菌生产的.林可霉素(lincomycin,又称洁霉素)及其氯化衍生物克林霉素(clindamycin)是一类迄今仍具有重要临床意义的抗生素,对革兰阳性菌(如厌氧细菌、好氧链球菌以及产青霉素酶的金葡球菌)以及革兰阴性菌均有效.林可霉素在临床上多用于治疗化脓性炎症和感染以及骨质炎症.也可作为抗疟疾药物.克林霉素具有巨大的药用价值,因为它是临床上少数几个抗革兰阴性厌氧菌的药物.

巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母是一种近年来广泛使用的基因表达系统 ,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点 .综述了该系统在载体类型、载体元件 (包括启动子、选择标记和信号肽序列 )、受体类型。

ubiCA基因的强化表达及对大肠杆菌辅酶Q生物合成的影响

为调查大肠杆菌高产辅酶Q(CoQ)的可能性,首先研究大肠杆菌生物合成关键基因ubiCA强化表达对大肠杆菌CoQ产量的影响。本文构建了含有ubiCA基因的5个表达质粒,将其分别转入E.coli JM 83或BL 21(DE 3)菌株中,定量分析这些转化子的辅酶Q产量。结果表明ubiCA基因在ubiC自身启动子(pub iCA-lacZF)介导下的表达最有效,重组菌CoQ产量达到对照的3.5倍,由此推测ubiCA基因的表达可能与其启动子序列有关。

过程启发式教学在基因组学课程中的实践

基因组学是生物科学专业的一门高级专业课,前沿性强。总结了对基因组学课程应用过程启发式教学方针进行教学的经验,包括激发学习兴趣,实施讨论式教学,教学内容模块化和灵活化等。实践证明,这些措施能大大提高学生学习的自主性和积极性。

大肠杆菌莽草酸生物合成途径的基因操作

为了调查大肠杆菌中相关基因的遗传操作对莽草酸途径和莽草酸积累的影响,利用温度敏感型质粒敲除了大肠杆菌JM83染色体DNA上编码莽草酸激酶的aroL基因,获得了该基因缺陷株JDL02;同时从大肠杆菌JM83染色体中分别克隆了aroG、ppsA和tktA3个基因,构建了多个表达质粒导入JDL02,得到了一系列重组菌。摇瓶发酵显示aroG基因的作用最为明显,各重组菌莽草酸产量均有不同程度的提高;在等生物量情况下,JDL02/pTrc-aroG-tktA的莽草酸产量是JM83的18.35倍,其摇瓶产量为94.33 mg/L。

基因组学课程体系与教学实践

基因组学是现代生命科学"组学"理论体系和研究方法中的核心,其教学存在内容多、难点多、进展快、对英文基础和前修课程知识要求高等特点。作者根据自身教学实践提出了适于生物科学本科专业教学的课程体系和经验体会,强调通过启发式思考题和小组讨论、创新实验、多媒体素材、双语习题等方式提升学生的学习自主性和课堂互动性。

苏氨酸操纵子的克隆表达及天冬氨酸激酶的测活

依据途径工程的基本原理 ,为构建大肠杆菌苏氨酸高产菌林 ,需强化表达苏氨酸生物合成途径中的关键基因。以EcoliMC4 10 0染色体DNA为模板 ,用PCR扩增了天冬氨酸激酶基因thrA部分片段 ,以之为探针从基因文库中克隆得到thr操纵子 ,包括启动子、结构基因 (thrA、thrB、thrC)、终止子。将结构基因装载于pET lla质粒上的T7启动子下游 ,得到了表达质粒pTHlla 0 8。转化E .coliBL2 1(DE3) ,经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明 ,天冬氨酸激酶的活性为含载体质粒pET lla的对照菌的 10

第三代基因工程—代谢工程

代谢工程 (MetabolicEngineering) ,亦称途径工程 (PathwayEngineering)和代谢设计 (MetabolicDesign) ,是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰 ,进而完成细胞特性改造的应用性学科。鉴于它涉及到多基因的联合协同表达控制机制 ,与传统的蛋白多肽单基因表达 (第一代基因工程 )以及基因定向突变 (第二代基因工程 )已有显著区别 ,故作者将之看作为第三代基因工程。

红色糖多孢菌红霉素抗性基因的克隆与鉴定

将红色糖多孢菌 ( Saccharopolyspora erythraea)的染色体 DNA用 Pst I酶切后与载体p UWL2 0 1连接 ,转化变铅青链霉菌 ( S.lividans) TK2 3的原生质体。采用双重抗性筛选得到了 9个转化子。分别抽提其中的质粒并再次转化原生质体 ,在含红霉素的平板上各筛选约 2 0 0个转化子 ,其中有 3个在抗性板上生长良好 ,分别命名为 p LP42、p LP1 b和 p LP44。对其中的 p LP42酶切分析表明 ,其含有约 3.0 kb的红色糖多孢菌 ( Saccharopolyspora erythraea)染色体 DNA片段 ,它的载体部分发生了缺失。以 p UC1 8为载体 ,将 p LP42的 1 .7kb- Kpn I片断克隆、测序、经与 Genebank的erm E基因顺序比较 ,证实已克隆了 Saccharopolyspora

抗生素Bagremycin生产菌Streptomyces sp. Tü4128接合转移系统的建立

基于噬菌体φC31 att/int系统,采用属间接合将来自大肠杆菌的DNA有效地导入菌株Tü4128的孢子中。通过条件优化,当融合温度为37℃时,在含80mmol/L MgCl2的ISP4培养基上使每个受体细胞的接合频率显著提高到7.3×10-3。Southern blot分析显示在受体菌染色体上存在单一的染色体附着位点(attB位点)。整合位点的DNA序列测序显示为保守。采用优化的方法建立了大肠杆菌和菌株Tü4128间高效的属间接合系统。

对一株藤黄微球菌合成海藻糖能力的鉴定

报道了一株藤黄微球菌 (Micrococcusluteus)具有产酶能力 ,可以淀粉糊精为底物合成海藻糖 ,从还原糖含量变化、纸层析和高效阴离子交换

基于创新平台的研究型人才培养模式探索

如何在高校不断扩招及现今"厚基础、宽口径"的教育模式下培养生物科学类专业学术型、创新型优秀本科人才?本项目以大学生创新项目为平台,确立了本科创新人才培养的内涵和多元组织形式,以学生兴趣为切入点,以科学研究思路为导向,将创新实验模块与学术型人才培养模式有效融合,以激发学生创新热情,充分发挥学生个性化的"设计与学习"能力,从根本上扭转传统教学模式中仅以教师为主的教学过程,从而适应21世纪生命科学的飞速发展对学术型优秀人才的迫切需求,向社会输送具有原创研究开发能力的新型生物科学专业人才。

本科优秀生创新素质培养模式的探索

本科优秀生的培养是高等学校塑造多领域、多层次、多规格人才的重要组成部分,这项工作实质上为我国高等院校教育模式的探索进行有限范围的示范性实践,尤其在我国目前高等教育资源相对不足的情况下,集中力量培养一批具有创新意识和能力的高质量人才,对国家的经济建设和社会发展意义重大。 每个学生都有潜在的创造力,但由于长期的应试教育,压抑了创造力的表现,素质教育正是为了唤起学生潜在的创造力,激发学生自身创造积极性的释放和发挥。

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

目的构建生产辅酶Q10的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tusB10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coliJM83中表达。同时利用H is-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q10。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol.L-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达Rhodobacter capsula-tusB10的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q10。

鳗弧菌Vibro anguillarum MVM425sh高效电转化条件的优化

目的建立高效的鳗弧菌电转化系统。方法分别从感受态细胞制备的洗涤缓冲液与浓度、复苏培养基、二级细胞收获时间、电转化的电压与脉冲时间等方面,对鳗弧菌的电转化条件进行优化。结果获得的鳗弧菌最佳转化条件为二级培养3h左右收获细胞,用272mmol/L蔗糖洗涤缓冲液制备电转化细胞,在2.0kV3ms的脉冲条件下,pUC18的转化率达106个转化子/μgDNA。结论采用优化的电转化方法,可获得较高的转化率,为鳗弧菌中的常规遗传操作奠定了良好的基础。

一种新型的基因定点突变方法及其在DdsA突变研究中的应用

为了发展基因突变技术,介绍一种新型的基因定点突变方法.该方法巧妙利用了基因序列中广泛存在的不完整的平端酶切位点.与传统方法相比,可以迅速地在全基因的任何部位替换核苷酸,并可以在突变实验过程中直接将目的基因克隆到T载体上,便于测序及进一步克隆.利用该方法成功地获得了DdsA(decaprenyl diphosphate synthase,十聚异戊二烯焦磷酸合成酶)在4个氨基酸位点上的19个变体酶.这些位点分布在基因的不同区域内.证明这种新方法的高效性.

大肠杆菌caiAB基因的克隆与表达

从E.coli MC4100菌株的染色体DNA中利用鸟枪法克隆含编码巴豆甜菜碱还原酶和L-肉碱脱水酶的caiAB基因片段,并经序列分析验证。由重组质粒pZJD-1480亚克隆得到pT7-A以及pT7-B重组表达质粒,后者转入E.coliBL21（DE3）菌株中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPT）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分子质量为40ku附近可见明显的表达蛋白带。