线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。

十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7的原核表达、纯化及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7并鉴定抗凝活性。方法运用RT-PCR扩增十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7成熟蛋白及其组成肽段AduNAP7A、AduNAP7B的编码序列;将编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a及pICET32,构建重组表达质粒;成功构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用镍亲和层析一步纯化融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白;先后用几丁质亲和层析及镍亲和层析两个步骤纯化自切割后带6×his-tag的目的蛋白;用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测纯化表达产物的体外抗凝活性。结果获得AduNAP7、AduNAP7A及AduNAP7B的编码序列并成功构建了原核表达重组质粒;AduNAP7、AduNAP7A及Adu-NAP7B均在大肠中得到了高效可溶表达,纯化产物具有一定抗凝活性,它们延长aPTT比延长PT更有效。AduNAP7B的抗凝活性显著强于AduNAP7及AduNAP7A。结论AduNAP7具有较强抗凝活性,但显著弱于AcAP5、AcaNAP7及AcAPc2。AduNAP7的抗凝效应可能利于钩虫在人体内的吸血寄生生活,其抗凝作用机制有待进一步研究。

广东省湛江市农村人群肠道蠕虫感染调查

目的了解湛江市农村人群肠道蠕虫感染现状。方法随机采集村民新鲜粪便,用直接涂片法及饱和盐水浮聚法检查虫卵,用盐酸左旋咪唑驱虫法检查感染钩虫种类。结果粪检190人,虫卵阳性78人,总感染率为41.1%。检出3种肠道蠕虫卵,其中钩虫感染率25.8%,蛔虫感染率12.1%,鞭虫感染率10.5%,有2种或3种虫卵阳性率为6.8%;不同地点各虫感染率不同;钩虫以50～70岁人群感染率较高,蛔虫、鞭虫以20岁以下人群常见;女性的钩虫感染率明显高于男性。药物驱虫后检获有十二指肠钩虫成虫、美洲钩虫成虫及雄性蛔虫,其中,十二指肠钩虫占钩虫比例87.4%,美洲钩虫占钩虫比例12.6%。结论湛江市农村人群感染蛔虫、鞭虫及钩虫常见,其中以钩虫感染最为严重。钩虫感染率较高与旱作生产生活方式密切相关。十二指肠钩虫在该地钩虫流行中占了重要地位。

犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析

目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36(AcaRPL36)及S4A(AcaRPS4A)全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining(NJ)法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490128)为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490129)为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。

十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因的克隆及原核表达

目的克隆十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因并在大肠杆菌中表达。方法运用3′RACE及RT-PCR技术分别扩增Ad-FAR-1 cDNA部分片段,获得序列经拼接后利用在线BLAST程序检索GenBank中相似的核酸序列及推导的氨基酸序列;设计引物,将Ad-FAR-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆到Ad-FAR-1全长cDNA序列并构建了pET32a/Ad-FAR-1原核表达重组质粒,Ad-FAR-1融合蛋白在大肠中得到了高效表达。结论成功获得并表达了十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因,为进一步研究该蛋白的特性与功能奠定了基础。

线虫抗凝血蛋白c2的融合表达及其抗凝活性分析

目的:在大肠杆菌中表达硫氧还蛋白-线虫抗凝血蛋白c2(Trx-NAPc2)融合蛋白,并检测其抗凝活性。方法:将扩增的NAPc2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET-32a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),分别经IPTG和乳糖诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用体外凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验检测抗凝血活性。结果:构建了pET-32a/NAPc2表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,纯化的Trx-NAPc2融合蛋白能明显延长PT及aPTT。结论:在大肠杆菌中高效表达了具有生物活性的Trx-NAPc2融合蛋白,为进一步研究NAPc2的功能及应用奠定了基础。

鱼类感染龙江血居吸虫的组织病理学研究

用组织连续切片法对人工感染有龙江血居吸虫的鲫鱼苗和金鱼进行了组织病理学研究。龙江血居吸虫成虫以寄生于鱼体的心脏为最常见 ,其它依次为前主静脉及其分支 ,后主静脉及肾门静脉 ,肝静脉及肝门静脉系统 ,动脉球及腹大动脉 ,鳃部动脉 ,较少寄生于右颈下静脉 ,尾静脉。成虫对宿主无明显的致病作用。鱼体的鳃丝、肾脏、肝脏、心脏组织是龙江血居吸虫虫卵数量分布较多的部位 ,脾脏、脑及鳍膜基部组织中也有少量虫卵分布。龙江血居吸虫对宿主的致病主要是由虫卵引起的。鳃部的虫卵可引起鳃丝肿胀变形 ,毛蚴逸出时即引起失血、炎症反应乃至死亡 ;累积在肝脏、肾脏。

龙江血居吸虫尾蚴及成虫的扫描电镜观察

用扫描电镜观察了龙江血居吸虫尾蚴及成虫体表的超微结构 .龙江血居吸虫尾蚴具有特化的头器 ,在头器顶端有 3种类型可能为感觉器的结构 :顶端外缘规则排列有一圈共 8个圆形的乳突状结构 ;在乳突状结构的下方有数个可能为感觉小窝的小凹陷结构 ;在头器的顶端外侧 ,乳突的内缘 ,至少有 4根纤毛状结构 .尾蚴身体各部均具有棘 ,体部的棘常形成棘环 .龙江血居吸虫成虫体侧具有粗大的棘 ,体侧边缘有隆起结构 ,虫体体表具有大量微毛及丰富的单纤毛感觉器 .

龙江血居吸虫幼虫发育各期及成虫的组织化学观察

对在实验室培养的含有人工感染龙江血居吸虫尾蚴发育各期的折叠萝卜螺进行了详细的组织学和组织化学观察 .龙江血居吸虫尾蚴发育过程大致可分以下 5期 :胚细胞期、胚球期、尾蚴胚体期、成熟尾蚴前期、成熟尾蚴期 .成熟尾蚴体内的腺体有 3种类型 :紧接在头器缢缩之后的一对腺体分泌富含酸性粘多糖类物质 ;体中背部 3对较大腺体分泌富含粘蛋白类物质 ;体中部另外有 5对腺体分泌富含糖原类物质 .此外 ,对实验室培养的含龙江血居吸虫成虫和虫卵的金鱼组织器官、含侵入0 .5～ 2

一种独特的fⅦa/TF抑制剂:线虫抗凝血蛋白c2

线虫抗凝血蛋白c2(NAPc2)是从犬钩虫中分离出来的一种蛋白,它通过结合于fXa的催化活性中心以外的部位而进一步特异性抑制fVⅡa/TF复合物。在国外,rNAPc2正作为一种新型抗凝药运用于临床试验中,它抗凝效果明显,半衰期长(>50 h),副作用小。此外,它还可能在治疗D IC、肿瘤等疾病方面具有潜在应用价值。本文就NAPc2的结构与功能、作用机制和临床应用研究进展做一综述并展望其应用前景。

Trx-NAP 5融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的:用大肠杆菌表达获得重组线虫抗凝血肽5(rNAP 5),为研究开发NAP5的功能与应用提供原料来源。方法:将扩增的NAP5基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与表达载体pET-32a连接。构建好的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,分别经IPTG和乳糖诱导表达,并探讨诱导表达条件,分析表达产物的可溶性情况。表达产物经镍亲和纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝活性。结果:成功构建了pET-32a/NAP5表达载体,IPTG和乳糖均能诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下每升LB培养基可获可溶性目的融合蛋白量达65.3mg。纯化的蛋白能明显延长PT及aPTT,7.0mg/L的蛋白平均约延长5.09倍aPTT,2.55倍PT。结论:在大肠杆菌中成功表达了具有很好生物活性的Trx-NAP5融合蛋白,为研究开发NAP5的功能与应用奠定了基础。

《寄生虫学与检验》实验课教学改革的探索

《寄生虫学及检验》是一门实践性和应用性非常强的学科,实验课是其主要组成部分。为了培养学生独立工作能力,本文结合教学实践,对《寄生虫学及检验》实验课教学改革进行了探索。主要通过调整教学内容,强化实验教学;分阶段实施教学,循序渐进提高学生实验技能;利用多媒体和网络资源,丰富教学内容等措施,提高了教学效果。

蛲虫核糖体DNA ITS1的PCR扩增及序列分析

目的扩增人蛲虫(Enterobius vermicularis)核糖体DNA的第一内转录间隔区(ITS1)。方法提取人蛲虫的基因组DNA,PCR扩增rDNA的ITS1及部分5.8S片段,对该片段进行PCR-SSCP分析并测序。结果扩增的片段大小为334bp,包含Enterobius vermicularis全部的ITS-1(303bp)及部分5.8S(31bp)序列,ITS1种内序列一致。结论首次报道人蛲虫的ITS1序列,将为以ITS1作为遗传标记用于蛲虫鉴别诊断、系统发育等研究奠定基础。

人体寄生虫学教学方法改革的探讨

鉴于当前医学高等教育的发展趋势和人体寄生虫学教学中遇到的问题,从多方面探讨了对教学方法的改革,以期增加学生学习的主动性,提高教学质量,提升学生综合素质。

凝血因子Xa直接抑制剂的研究现状及应用

抗凝药物在血栓性疾病的预防和治疗中具有重要地位。抗凝治疗是防治静脉血栓栓塞症(VTE)、心房颤动(AF)和急性冠状动脉综合征(ACS)的重点,由于传统药物的局限性,凝血因子Xa抑制剂成为了研究的热点药物并逐步走向临床。本文对凝血因子Xa直接抑制剂的研究现状进行回顾,并对其临床应用及临床试验研究结果进行综述。

蛋白质组学在药物研究中的应用进展

随着基因组学、组合化学和高通量筛选等现代科技的发展,以药物发现为中心的药物研究不断取得新的突破。特别是蛋白质组学这门新科学的发展,大大加速和简化了新药开发的过程。蛋白质组学作为一种全新的技术平台,正日益广泛地应用于药物研究中。本文主要就蛋白质组学的相关概念、技术及其在药物研究中的应用进展作一综述。