抗菌肽PR39真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用

目的构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用。方法采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和免疫荧光法检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果成功构建了抗菌肽PR39的真核表达载体pIRES2-GFP/PR39,并能在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达抗菌肽PR39。表达抗菌肽PR39的巨噬细胞杀灭和清除胞内菌的能力明显增强。结论抗菌肽PR39基因能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达并发挥抗菌作用。

携抗菌肽PR39基因重组腺病毒的构建及抗胞内伤寒菌研究

目的构建抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体,观察其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌活性。方法PCR扩增抗菌肽PR39成熟肽基因,插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,经PmeI线性化后与腺病毒骨架(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体(pAd-PR39)。重组腺病毒载体经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒(Ad-PR39)。利用重组腺病毒感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用RT-PCR和免疫细胞化学检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果先后构建了携抗菌肽PR39基因的穿梭载体和重组病毒载体,包装出重组腺病毒,并成功感染小鼠巨噬细胞RAW264.7。感染重组腺病毒的小鼠巨噬细胞RAW264.7能有效表达抗菌肽PR39。与对照(10.8±2.1CFU/cell)相比,感染重组腺病毒的小鼠巨噬细胞RAW264.7具有更强的杀灭胞内伤寒菌的能力(7.2±1.8CFU/cell)。结论构建的重组腺病毒能够感染小鼠巨噬细胞RAW264.7并发挥抗菌作用,为抗菌肽PR39在胞内菌感染基因治疗中的应用奠定了实验基础。

巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建及靶向性研究

目的:构建巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体。方法:PCR方法合成巨噬细胞特异性启动子,并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pEGFP-N1中,替代CMV启动子。利用脂质体转染法,将其与红色荧光蛋白真核表达载体(pERFP-N1)共转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察GFP和RFP在不同细胞中的表达水平来鉴定启动子的靶向性。结果:成功构建了巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体,并且能在巨噬细胞中高效特异性地表达报告基因。结论:构建的靶向巨噬细胞的真核表达载体能提高目的基因的表达特异性,为提高基因治疗胞内菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了实验基础。

家蝇幼虫抗菌肽对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌活性

通过超声处理诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,观察抗菌肽对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌作用。超声处理诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,经分离纯化后,体外试验分析抗菌肽的抑菌特性。结果表明,术后对照组小鼠相比其他两组活动减少,且3组白细胞计数均减少。14 d后对照组存活率为30%,明显少于磺胺米隆组90%(P<0.05)和抗菌肽组80%(P<0.05)。对照组小鼠的重量在第6 d开始下降,明显少于其他两组(P<0.05)。而无菌对照组无死亡,重量持续增加。因此,超声处理能诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,其对铜绿假单胞菌感染的ICR小鼠创面有较强抗感染作用,能明显增加其存活率。

肿瘤患者外周血活化血小板测定及其临床意义

目的:比较不同疾病状态下活化血小板测定值的差别及使用阿司匹林防治血栓的效果。方法:采用流式细胞仪测定126例肿瘤患者和60例非肿瘤患者外周血活化血小板CD62p和CD63的表达量,以及服用阿司匹林后的变化。结果:肿瘤患者外周血的活化血小板CD62p和CD63的表达量明显高于非肿瘤患者(P<0.05),有血栓形成的肿瘤患者外周血的活化血小板CD62p和CD63的表达量明显高于无血栓形成的肿瘤患者(P<0.05),有血栓的肿瘤患者的活化血小板经过阿司匹林干预治疗后明显下降(P<0.05)。结论:测定活化血小板可以预测肿瘤患者存在高凝状态风险性的大小。同时,服用小剂量肠溶阿司匹林可以降低外周血活化血小板CD62p和CD63的值。

天蚕素A截短肽在大肠埃希菌中的高效表达及活性分析

将构建好的含抗菌肽天蚕素A(cecropin A,CA)截短肽CA19(36、210)1～5倍串连体的pET-31b(+)载体进行诱导表达,其表达量比单体表达明显提高。将融合蛋白用亲和层析法将其纯化,其纯度达到90%以上。纯化融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了其特异的多克隆抗体。纯化串连融合蛋白用溴化氰切割成单体检测其活性,发现均具有抑菌活性。本研究为抗菌肽的基因工程制备提供了新途径。

靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因抗胞内结核分枝杆菌的研究

目的:观察靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因的腺病毒在小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠肺部的表达及抗结核分枝杆菌活性。方法:利用携巨噬细胞启动子和抗菌肽PR39基因的重组腺病毒感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠肺部,采用荧光免疫技术检测PR39在小鼠肺部表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果:重组腺病毒能够成功感染RAW264.7,并有效表达抗菌肽PR39。与对照相比,感染重组腺病毒的RAW264.7具有更强的杀灭胞内BCG的能力,同时,重组腺病毒能够成功感染小鼠肺部,并表达目的基因。与对照相比,感染重组腺病毒的小鼠肺部的BCG活菌数明显减少。结论:靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因在体内外均能够发挥抗胞内BCG作用,为抗菌肽PR39在胞内菌感染基因治疗中的应用奠定了实验基础。

胆总管结扎对小鼠肝脏炎症和细胞凋亡的影响

目的:探讨胆总管结扎引起的胆汁淤积对小鼠肝脏细胞凋亡和炎性细胞浸润的影响。方法:采用胆总管结扎手术制备胆汁淤积小鼠模型;利用全自动生化分析仪检测小鼠血清肝脏生化指标水平;用末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick end labeling,TUNEL)检测小鼠肝脏细胞凋亡;用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测肝脏炎症相关基因表达情况。结果:通过胆总管结扎手术成功制备了梗阻性胆汁淤积小鼠模型;小鼠血清生化指标结果表明小鼠肝脏功能受损,胆总管结扎手术成功;胆总管结扎引起胆汁淤积后,肝脏细胞凋亡和坏死明显增加,炎症细胞浸润增强。结论:胆汁淤积导致肝脏细胞凋亡、坏死和炎症活动增强是胆总管结扎致肝纤维化过程中的重要表现。

家蝇幼虫抗菌肽对阴沟肠杆菌感染小鼠创面的抗菌活性

目的:观察抗菌肽对阴沟肠杆菌感染小鼠创面的抗菌作用。方法:超声处理诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,经分离纯化后,体外实验分析抗菌肽的抑菌特性。取ICR小鼠30只,切除背部1cm×1cm全层皮肤,涂抹阴沟肠杆菌菌液作为感染模型,随机分为3组。伤后2h和每天各组分别用等渗生理盐水、100g/L的磺胺米隆或0.1g/L抗菌肽滤纸湿敷,伤前和伤后3d抽血观察白细胞变化;伤后3d痂下肌肉组织细菌定量和计算存活率。结果:抗菌肽纯化蛋白对阴沟肠杆菌的抑菌活性较强;术后3组白细胞记数均减少,对照组显著低于其他两组(P<0.05);痂下肌肉组织细菌定量抗菌肽组(99±32)×102CFU/g和磺胺米隆组(87±31)×102CFU/g,均显著低于对照组(504±338)×103CFU/g(P<0.01);对照组伤后3d存活率明显少于其他两组(P<0.05)。结论:超声处理能诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,其对阴沟肠杆菌感染的ICR小鼠创面有较强抗感染作用。

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的构建人胱抑素C(cystatin C,Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备CysC抗血清。方法从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32(a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测。结果测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2+亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体。

特异性小干扰RNA沉默Annexin Ⅱ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭迁移力的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默Annexin Ⅱ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭迁移力的影响。方法:体外化学合成Annexin Ⅱ基因序列特异性双链小干扰RNA(Annexin Ⅱ-siRNA),转染高转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,用荧光显微镜观察转染效率,逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测Annexin Ⅱ mRNA和蛋白表达水平;通过生长曲线和体外侵袭迁移实验,观察乳腺癌细胞恶性生物学行为的改变。结果:Annexin Ⅱ-siRNA能有效抑制Annexin Ⅱ mRNA和蛋白表达(P<0.05);经siRNA处理的细胞,细胞生长速度明显降低(P<0.05),侵袭迁移力显著下降(P<0.05)。结论:沉默Annexin Ⅱ基因表达可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭迁移力。

家蝇幼虫抗菌肽的超声诱导及分离纯化和活性研究

目的:分离纯化家蝇(Musca domestica)幼虫免疫血淋巴中的抗菌肽,研究抗菌肽的性质和抑菌特性。为进一步研究家蝇幼虫抗菌肽的产生及应用提供实验基础。方法:通过超声处理诱导家蝇幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,结合高速离心,两步CM-Sepharose离子交换层析,冷冻干燥浓缩等步骤,分离得到一种具抗菌活性的蛋白质。用Tricine-SDS-PAGE鉴定抗菌肽的纯度和性质,抑菌试验分析抗菌肽的抑菌特性。结果:300W,50Hz超声处理60s能够诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,经分离纯化后Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示为一条带,相对分子量大约为5.8kD。纯化蛋白对阴沟肠杆菌,绿脓杆菌等G-杆菌的抑菌活性较强,而对金黄色葡萄球菌效果不显著。结论:诱导和纯化了一种家蝇幼虫抗菌肽,为此类活性物质的分离纯化提供了有效的方式。

RNA干扰沉默STAT3基因表达对膀胱癌细胞生长影响的实验研究

目的探讨应用RNA干扰技术沉默信号转导和转录激活因子3(STAT3)基因对膀胱癌T24及5637细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人膀胱癌T24及5637细胞。通过半定量RT-PCR、Western印迹检测STAT3基因不同水平的表达情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、流式细胞仪检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果成功构建pGenesil-1-shR-NA-STAT3重组质粒,并成功转染T24及5637膀胱癌细胞;半定量RT-PCR、Western印迹检测结果显示,重组质粒实验组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组(P<0.05);MTT实验、流式细胞仪检测结果显示,重组质粒实验组细胞的增殖明显受到抑制并出现凋亡现象。结论pGenesil-1-shRNA-STAT3转染T24及5637膀胱癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制膀胱癌细胞的生长及增殖。

抗菌肽PR-39真核表达载体的构建及表达检测

目的:构建富含脯氨酸精氨酸的39位氨基酸抗菌肽(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)的真核表达载体,并检测它在293T细胞中的表达情况。方法:以含有PR-39核心编码区(Core coding regions,CDS)序列的质粒pBluescriptⅡSK-PR-39为模板,PCR扩增PR-39CDS序列并测序。扩增片段插入真核表达质粒pGC-FU中,构建包含PR-39基因的重组表达质粒pGC-FU-PR-39。阳性克隆用限制性内切酶酶切及测序鉴定后用脂质体2000转染293T细胞,荧光显像观察其转染效率,Western blot检测目的蛋白表达情况。结果:成功扩增出PR-39基因,通过酶切测序鉴定证明成功构建了包含PR-39的真核表达载体pGC-FU-PR-39,转化293T细胞24h后观察到荧光,Western blot检测到目的蛋白。结论:本实验成功构建PR-39真核表达载体,并能在293T细胞中表达PR-39-GFP融合蛋白,这为进一步研究PR-39的作用奠定了基础。

基于序列分析的天蚕素A串连融合表达载体的构建

天蚕素A(Cecropin A,CA)是来源于惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)的含有37个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广等特点。为降低天蚕素A对宿主的毒性及提高其表达丰度和稳定性,在序列分析的基础上设计了3条天蚕素A氨基酸序列,分别为CA19、CA36和CA210。根据大肠杆菌密码子的偏爱性分别合成相应的3对寡核苷酸链,并通过重叠PCR方法合成成熟肽CA。将含有CA19、CA36、CA210和CA1～5个拷贝基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和BLR(DE3)PlysS,成功构建了串连融合表达载体,为下一步的抗菌活性及免疫表位的分析打下基础。

巨噬细胞特异性启动子/抗菌肽PR39基因腺病毒载体的构建及其表达

旨在构建由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体,检测目的基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达。PCR扩增巨噬细胞启动子/抗菌肽PR39成熟肽基因序列,插入腺病毒穿梭载体pAdTrack中,重组穿梭质粒(pAdTrack-SP/PR39)与腺病毒骨架(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体(pAd-SP/PR39)。pAd-SP/PR39经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒(Ad-SP/PR39)。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。成功构建了由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体。包装出的重组腺病毒仍然能感染小鼠巨噬细胞且高效表达抗菌肽PR39。构建的重组腺病毒能够在巨噬细胞中表达抗菌肽PR39基因,为靶向表达抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用奠定了基础。

AnnexinⅡ在4株人乳腺癌细胞中的表达及意义

目的:研究人乳腺癌细胞中AnnexinⅡ基因的表达情况,阐明AnnexinⅡ基因与乳腺癌细胞侵袭力的关系.方法:采用SYBR实时荧光定量PCR,Western Blot技术分别检测MDA-MB-435S,MDA-MB-231,ZR-75-30和MCF-7共4株人乳腺癌细胞AnnexinⅡ mRNA和蛋白的表达情况;免疫细胞化学检测AnnexinⅡ蛋白在4株人乳腺癌细胞中的定位;Millicell小室测定4株人乳腺癌细胞体外侵袭能力.结果:MDA-MB-435S,MDA-MB-231,ZR-75-30和MCF-7的AnnexinⅡ mRNA表达量分别为0.67±0.21,0.38±0.03,0.05±0.03,(4.06±0.81)×10-5,任两组细胞间AnnexinⅡ mRNA的表达量差异均有统计学意义(P<0.05);MDA-MB-435S,MDA-MB-231,ZR-75-30和MCF-7的AnnexinⅡ蛋白表达量:WesternBlot结果分别为1.47±0.06,1.10±0.05,0.70±0.03,0.09±0.01;免疫细胞化学结果分别为3423±312,2767±147,2001±245,353±128;任两组细胞间AnnexinⅡ蛋白表达量差异均有统计学意义(P<0.05);MDA-MB-435S,MDA-MB-231,ZR-75-30和MCF-7的体外侵袭力分别为135.3±7.6,147.2±8.9,79.4±2.9,15.3±4.4,除MDA-MB-435S细胞与MDA-MB-231细胞无显著差异外,其余两组细胞侵袭力有显著性差异(P<0.05).结论:在所检测的4株人乳腺癌细胞中,AnnexinⅡ表达量与细胞体外侵袭力呈正相关.

胆总管结扎引起胆汁淤积对小鼠肝脏细胞增殖的影响

目的:探讨胆总管结扎引起的胆汁淤积对小鼠肝脏增殖的影响.方法:采用胆总管结扎手术制备胆汁淤积小鼠模型;利用全自动生化分析仪检测小鼠血清肝脏生化指标水平;用免疫组织化学方法检测小鼠肝脏中增殖相关的指标的表达情况.结果:通过胆总管结扎手术成功制备了梗阻性胆汁淤积小鼠模型;小鼠血清生化指标以及病理组织学变化表明小鼠肝脏功能受损,胆总管结扎手术成功;胆总管结扎引起胆汁淤积后,肝脏细胞有丝分裂相增加,肝细胞和胆管细胞中增殖相关的标志物表达升高,表明细胞增殖活性增强.结论:胆总管结扎引起的胆汁淤积可以引起肝脏细胞以及胆管上皮细胞的增殖.

特异性靶向巨噬细胞表达PR39的重组腺病毒抗胞内菌感染能力检测

目的检测巨噬细胞靶向表达PR39的重组腺病毒Ad-SP/PR39在抗胞内菌方面的作用。方法重组腺病毒Ad-SP/PR39经CsCl密度梯度离心纯化,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GPF的表达并检测重组腺病毒的滴度。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7、人结肠癌细胞株Lovo、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株ZR-75-30和非洲绿猴肾细胞株COS-7后,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。将含Ad-SP/PR39的RAW264.7细胞裂解液作用于减毒结核分枝杆菌(BCG),检测其体外杀灭结核杆菌BCG的能力。另取RAW264.7细胞,吞噬BCG后,加入Ad-SP/PR39感染该细胞并检测细胞内活菌量,以观察其细胞内杀菌作用。结果经纯化后的重组腺病毒滴度可达5×1011efu/ml,能够有效感染小鼠巨噬细胞RAW264.7等多种细胞株。RT-PCR及免疫细胞化学技术检测各株细胞转录水平表达情况显示小鼠巨噬细胞RAW264.7能高效表达抗菌肽PR39,而其他细胞株几乎没有表达。与感染对照腺病毒Ad-C的RAW264.7细胞相比,转染Ad-SP/PR39的细胞显示出了更强的抗菌活性[BCG活菌数分别为(8.5±1.4)×106、(6.9±1.8)×106cfu/ml,P<0.05)],且能有效吞噬并杀灭胞内菌。结论本课题组构建的重组腺病毒能够靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因,发挥抗胞内菌作用,为抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用开辟了新思路。

siRNA沉默AnnexinⅡ基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S的影响

目的探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默AnnexinⅡ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S生物学特性的影响。方法体外化学合成AnnexinⅡ序列特异性双链小干扰RNA(siRNA),脂质体介导转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S,采用荧光显微镜观察转染效率。收集siRNA干扰的细胞,RT-PCR、蛋白印迹和免疫细胞化学法分别检测AnnexinⅡmRNA和蛋白的抑制水平,并采用MTT法、流式细胞术测定细胞增殖能力和细胞周期的变化,Millicell小室测定细胞侵袭、迁移能力的变化。结果AnnexinⅡ-siRNA能有效抑制AnnexinⅡmRNA和蛋白的表达(P<0.05);经siRNA干扰后的细胞,细胞增殖能力显著减低(P<0.05);G0/G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少(P<0.05);细胞侵袭、迁移能力明显降低(P<0.05)。结论采用siRNA干扰AnnexinⅡmRNA和蛋白表达后,能有效逆转乳腺癌细胞的某些恶性生物学特点,表明AnnexinⅡ与乳腺癌的发生、发展及转移有一定的关系。