免疫磁珠富集水中鲤春病毒血症病毒的初步研究

为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术对水中SVCV进行检测。结果显示,1 mg磁珠与75μg SVCV多克隆抗体耦联时,耦联的抗体量最大,耦联率为98.48%;耦联后的免疫磁珠对SVCV(200μL,浓度为1.54×10^(6)拷贝/μL)的富集效率最高为91.56%。以该多克隆抗体量制备的免疫磁珠富集10倍倍比稀释的SVCV(3.54×10^(6)拷贝/μL~3.54×10^(3)拷贝/μL),以确定其有效富集SVCV的最低浓度。结果显示,1 mg免疫磁珠能够使200μL病毒液(3.54×10^(3)拷贝/μL)富集率达到61.58%。表明该免疫磁珠能够有效富集SVCV。在免疫磁珠分离技术联合RT-qPCR技术检测水样品中SVCV(浓度约为1.16×10^(4)拷贝/μL)的结果显示,免疫磁珠组富集SVCV核酸量是裸磁珠组富集SVCV核酸量的1.77×10^(3)倍,是未处理组富集SVCV核酸量的1.68×10^(3)倍,免疫磁珠组富集SVCV均极显著高于裸磁珠组和未处理组(P<0.01),裸磁珠组富集的SVCV与未处理组则无显著差异(P>0.05)。本研究首次建立了一种能够有效富集水中SVCV的方法,为SVCV的监测提供了技术手段。

鲑鳟鱼病毒性疫病现场快速检测发展现状与展望

鲑鳟鱼是鲑科家族所有鱼类的总称,是典型的冷水性鱼类,具有很高的营养价值和经济价值[1]。联合国粮食及农业组织在2022年水产养殖的报告中指出,近几十年来,鲑科鱼特别是养殖的大西洋鲑(Salmo salar)一直是全球渔业和水产养殖产品贸易增长的主要贡献者之一[2]。中国养殖鲑鳟鱼类已有50余年的历史,有大西洋鲑、白点鲑(Salvelinus leucomaenis)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、哲罗鲑(Hucho taimen)等10余个养殖品种[1]。据统计,2022年我国鲑鳟鱼养殖总产量约4.03万t[3]。随着我国水产养殖规模的逐渐扩大和相关产业及贸易的发展,水生动物疫病带来的风险和负面影响也愈发显著。2021年,我国水产养殖因病害造成的经济损失约为539亿元[4]。水产养殖病害也成为现阶段威胁我国鲑鳟鱼产业发展的重要因素。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

鱼类细胞系研究现状

鱼类细胞系是研究鱼类病毒学、生理学、毒理学、免疫学和分子遗传学的重要材料和重要的体外研究系统。鱼类细胞系的组织来源包括脑、心脏、鳃、肾脏、鳍条和卵巢等各种组织。目前已至少建立并应用了826株鱼类细胞系。本文综述了近年来鱼类细胞系的组织来源、培养方法及应用现状,旨在为鱼类细胞系研究提供最新的数据支撑。

2018-2022年鲫造血器官坏死病病原检测能力验证结果分析

通过开展鲫造血器官坏死病(CHN)病原检测能力验证,不断提高中国鲫造血器官坏死病病原检测的整体水平,加强相关实验室鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)检测能力,2018—2022年期间开展了5次该能力验证项目。能力验证样品经均匀性和稳定性检验后,随机组合成每组4份样品发放。依据GB/T 36194—2018《金鱼造血器官坏死病毒检测方法》中推荐的聚合酶链式反应(PCR)方法进行检测,并对各参加单位提交的检测结果进行评价。2018—2022年全国共有411家/次实验室参加,测试结果满意率依次为86.57%、83.10%、86.50%、87.74%和85.86%。能力验证统计结果表明,大部分实验室具备了鲫造血器官坏死病病原检测能力和质量管理水平,可以承担该病原的检测和监测工作,为鲫造血器官坏死病监测预警提供了有力支撑。

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线(T)和质控线(C)。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。

鲤鱼双线绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育关系分析

为了鉴定天津市某养殖场鲤鱼腹腔内寄生的“面条样”虫体,本试验通过PCR方法扩增虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列,并进行分子鉴定和基因测序,分析3种基因的同源性、分子进化和系统发育关系。结果显示,寄生于鲤鱼体内的虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列分别与双线绦虫分离株MN204040.1(中国)、MN219466.1(中国)和EU241209.1(法国)的核苷酸序列同源性较高,为99.45%、98.74%和99.26%。基于18S rRNA、COⅠ和COB基因序列构建的系统发育树显示,本试验分离的绦虫裂头蚴与GenBank数据库中已鉴定的双线绦虫聚在同一分支上,且与双线绦虫中国武汉分离株的种属亲缘关系较近。本试验初步阐明获得的天津市双线绦虫分离株与其他种属之间的系统发育关系,为双线绦虫的分子鉴定和系统发育关系分析提供了数据支持。

黄海希瓦氏菌单抗介导间接ELISA快速检测技术的建立

应用农业部海洋水产增养殖学重点实验室制备的特异性抗黄海希瓦氏菌Shewanella smarisflavi AP629单克隆抗体3D9作为一抗,以碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠Ig作为酶标二抗,建立了仿刺参Apostichopusjaponicus"化皮病"病原菌——黄海希瓦氏菌AP629的间接ELISA快速检测方法,并进行了条件优化。结果表明:抗原的最佳包被浓度为107个/mL,一抗工作的最佳稀释度为1∶32,病原菌的检测灵敏度为5×105个/mL。该方法特异性强,与希瓦氏菌属其它种类、弧菌和气单胞菌等均无交叉反应。该方法的建立有助于快速准确地诊断由黄海希瓦氏菌AP629引起的仿刺参疾病。

病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其特性分析

目的制备抗病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的单克隆抗体(mAb)。方法以差速离心法提纯VHSV作为免疫原,免疫BALB/c小鼠。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,间接ELISA进行筛选检测,且对mAb进行特性分析。结果制备出1株抗VHSV mAb,命名为4A5。对其进行特性分析结果显示该抗体腹水效价104以上;属于IgG3型,κ链;仅与VHSV本身反应,与其他病毒和细胞均不发生交叉反应;对应的抗原位点在VHSV蛋白的相对分子质量(Mr)70 000的条带处,该蛋白带是VHSV的G蛋白。结论制备出的特异性好的抗VHSV mAb,为该病毒的快速诊断及流行病学监测提供了检测试剂。

草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

研究以纯化的羊抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体作为捕获抗体,抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体为检测抗体,建立草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法,其最佳反应条件是:羊多克隆抗体包埋浓度为2.5μg/m L,抗草鱼呼肠孤病毒单克隆抗体工作浓度为1:400稀释,以3%牛血清白蛋白作为封闭液。该方法的检测限为5×105 pfu/m L,且能够特异性检出发病草鱼内脏组织中的草鱼呼肠孤病毒。特异性试验结果表明该方法具有较高的特异性,与病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤春血症病毒等水产动物病毒株均不反应。该方法还具有较好的稳定性。

传染性造血器官坏死病进境风险分析

为评估传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)随国际贸易传入我国的风险,按照世界动物卫生组织(WOAH)动物卫生风险评估框架,从危害识别、风险评估及风险管理3个方面开展风险分析。结果显示:IHNV随活易感鱼类(包括亲鱼、鱼卵和鱼苗)和鲜活饵料鱼类(野杂鱼)传入的风险为“高”;随非易感鱼类及运输活鱼的水、包装、运输工具和用具等传入的风险为“很低”;随食用易感鱼类(包括活的、冷冻的、冰鲜的以及鱼肉)和易感鱼加工产品传入的风险为“可忽略”。根据以上风险评估结果提出相应风险管理措施:不从疫区进口高风险产品,低风险产品可以自由贸易,对来自疫区的非易感鱼类和运输活鱼的水、包装、运输工具和用具实施消毒。

鲤春血症病毒单克隆抗体建立及免疫学特性鉴定

制备高特异性的抗鲤春血症病毒单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。采用差速离心法提纯的鲤春血症病毒作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,4次免疫后,利用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出高敏感的特异性抗鲤春血症病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水制备抗鲤春血症病毒单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。融合后筛出两株杂交瘤细胞株9C11和1C12,亚型均为IgG2b型,κ链;间接ELISA测定腹水效价为104,与其他病毒株和细胞株不发生反应;western-blot结果显示单克隆抗体对应的抗原位点在相对分子质量(Mr)230 000的条带处;免疫氧化酶染色结果显示单克隆抗体能够特异地识别感染细胞内的鲤春血症病毒。本实验制备的抗鲤春血症病毒单克隆抗体特异性好,为鲤春血症病毒免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

2014—2016年全国草鱼出血病病原检测能力情况分析

为了进一步加强水生动物防疫系统实验室能力建设,提升水生动物疫病检测水平,推动实验室能力认证认可,建立和完善实验室考核管理机制,2014—2016年农业部全国水产技术推广总站委托中国检验检疫科学研究院组织开展了草鱼出血病病原检测能力验证项目。3年参试实验室共计69家次,满意结果从53%上升到88%。结果表明,通过3年测试,全国草鱼出血病病原检测能力提升较快,为该病的诊断与防控提供了技术支撑。

玻勒虹彩病毒单克隆抗体的制备及初步应用

为了制备抗玻勒虹彩病毒(Bohle virus,BIV)的单克隆抗体,应用杂交瘤细胞技术,制备了1株稳定分泌抗玻勒虹彩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3A4),并对其单克隆抗体特性进行分析和初步应用。结果表明:单抗3A4腹水效价为105以上,属于Ig G3型,κ链;单抗3A4与大鲵虹彩病毒(ADIV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)发生反应,与其他病毒株和细胞株不发生反应;单抗3A4可识别相对分子质量为50 000的蛋白;应用捕获ELISA方法对样品进行检测,建立的捕获ELISA方法能用于蛙病毒的检测。该单抗为BIV的快速诊断及流行病学监测提供了检测试剂。

赤羽病研究概况

赤羽病是由赤羽病病毒引起的一种虫媒传染病,该病在热带和温带的许多国家和我国大部分地区广泛流行,给世界畜牧业造成了巨大的经济损失。赤羽病毒属于布尼病毒科布尼病毒属辛波血清群,主要通过吸血昆虫(如蚊和库蠓)叮咬易感反刍动物进行传播,怀孕绵羊、山羊和牛最易感,临床上以流产、早产、死胎和先天性畸形为特征。论文对赤羽病病原学、流行病学、发病机制与病理变化、诊断及防控措施等方面的进展进行综述,以期为预防控制赤羽病的发生和流行提供参考。

草鱼呼肠孤病毒VP5蛋白的表达与纯化

从草鱼Ctenopharyngodon idellus出血病病原——草鱼呼肠孤病毒GCRV-873株扩增病毒的外壳蛋白(GCRV-VP5)基因,并将GCRV-VP5基因克隆到原核表达载体pET-30α,转化至大肠杆菌E.coli BL-21(DE3)中后,用IPTG诱导培养,获得带有重组质粒菌体的总蛋白。用GCRV-873毒株免疫山羊得到的抗血清作为一抗进行免疫印迹试验,结果在硝酸纤维素膜上检测到在相对分子质量为77 000处有特异性免疫条带,与预测的GCRV-873 VP5蛋白一致,提示大肠杆菌融合表达草鱼出血病病毒的VP5蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,经柱层析纯化后蛋白纯度可达90%。本试验中获得的融合蛋白可为后期免疫动物提供了抗原,也为建立GCRV免疫学检测方法提供了依据。

蛙病毒三重荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中收录的蛙病毒属虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计了一对通用引物和3条Taqman探针，通过PCR反应体系的优化以及反应的特异性、灵敏性和干扰性试验，建立了一种可检测蛙病毒属大部分成员并能进行初步分类的三重荧光PCR方法。通过鉴定分析将蛙病毒属成员分为三类，其中第一类包括蛙病毒3型（FV3）、饰纹汀蛙虹彩病毒（BIV）、流行性造血器官坏死病毒（EHNV）、欧洲鲴鱼病毒（ECV）、欧鲶病毒（ESV）、中华鳖虹彩病毒（STIV）、大鲵虹彩病毒（ADIV）、沼泽绿牛蛙虹彩病毒（RGV）和虎纹蛙病毒（TFV），第二类是Santee．Cooper蛙病毒（SCRV），由大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）、裂唇鱼病毒（DFV）和孔雀鱼病毒（GV6）组成，而新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）则单独作为第三类。进一步分析发现各病毒的最低检测量均达到10^2拷贝，表明该方法除了具有良好的特异性和稳定性之外还具有高度灵敏性。建立的该蛙病毒三重荧光PCR方法可为蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供一种有效的技术手段。

金鱼造血器官坏死病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV)是一种可感染金鱼等鲤科鱼类,并可导致其死亡的疱疹病毒。为了快速检测病原,本研究根据GFHNV的主要衣壳蛋白(Major captor protein,MCP)序列中的一段保守基因序列,设计引物和Taq Man探针,建立了GFHNV特异性的实时荧光定量PCR检测方法 ;并利用PCR反应扩增出的MCP基因,制备了p UC-GFHNV重组质粒作为阳性对照。经试验,该方法检测限最低可达10个拷贝数的目的基因,而且与锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)、甲鱼虹彩病毒(Softshell turtle iridovirus,STIV)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis,EHNV)、斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)以及白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)等5种水生动物病毒无交叉反应。该方法具有简便、快速、敏感、特异等优点,为该病的诊断与病原检测提供了一个重要手段。

锦鲤疱疹病毒病病原检测能力验证结果分析

为了提高中国锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病原检测的整体水平,加强相关实验室检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的能力,2014—2016年开展了3次能力验证项目。能力验证样品为盲样,使用鲤鱼组织匀浆液,与包含了KHV TK基因片段和Sph基因片段的2种重组质粒溶液混合制成。对盲样进行了均匀性和稳定性检测。采用水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法第1部分:锦鲤疱疹病毒》(SC/T 7212.1-2011)中,推荐使用的聚合酶链式反应(PCR)方法进行病毒检测,并对各参加单位锦鲤疱疹病毒的检测结果进行分析。2014年能力验证第一轮测试结果满意率为58%,第二轮满意率为96%;2015年能力验证第一轮测试结果满意率为77%,第二轮满意率为89%;2016年能力验证第一轮测试结果满意率为82.69%,第二轮满意率为92.73%。通过2014—2016年的能力验证活动,大多实验室具备了锦鲤疱疹病毒PCR检测能力和质量管理水平,可以承担锦鲤疱疹病毒的检测和监测工作。

流行性造血器官坏死病病毒抗原捕获ELISA建立

使用差速离心浓缩的病毒免疫山羊,获得高免血清并提取IgG,即为抗流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)多克隆抗体。利用纯化的EHNV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经有限稀释法亚克隆,获得杂交瘤细胞株。将杂交瘤接种小鼠诱生腹水获得单抗3A4。以抗EHNV多克隆抗体为捕获抗体,单抗3A4为检测抗体,使用HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗,建立了EHNV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出103TCID_(50)的病毒液上清和0.0056!g的MCP重组蛋白。对纯化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV病毒液进行检测,结果均为阴性,未发现交叉反应。本研究建立的EHNV抗原捕获ELISA方法,具有敏感、特异和重复性好的特点。通过应用于人工感染样品和临床样品的检测进一步证实了本检测方法的实用性。