针对HLA-I类分子高效基因编辑方法的建立及其应用

目的:建立一种HLA-I类分子高效基因编辑的方法,以制备编辑HLA-I类通用型造血干细胞。方法:针对β2微球蛋白基因设计并合成sgRNA,将NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA按照不同的摩尔比(1∶1-1∶4)形成RNP复合物,分别设置对照组和四个转染组,通过核转染方式转入HEK-293细胞或者CD34+造血干细胞。培养72 h后,应用流式细胞术检测转染细胞表面HLA-I类分子表达情况,T7E1酶切反应鉴定切割作用,DNA直接测序方法鉴定序列套峰出现情况。结果:流式细胞术检测发现转染后HEK-293细胞或者CD34+造血干细胞有不同程度的HLA-I类分子阴性表达细胞群,直接测序不同转染组在sgRNA PAM序列附近均有明显套峰出现。在HEK-293细胞转染中,NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA摩尔比为1∶4时HLA-I类分子阴性表达细胞群比例最高(87.69±0.83)%,摩尔比为1∶3时T7E1酶切割效率最高(38±2.0)%。在CD34+造血干细胞转染中,NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA摩尔比为1∶2时,HLA-I类分子阴性表达细胞群比例为(91.56±3.39)%,摩尔比为1∶1时T7E1酶切割效率为64±8.45%。结论:本研究提供了一种针对HLA-I类分子进行高效基因编辑的方法,该方法可以有效地将细胞表面的HLA-I类分子进行沉默表达,并成功应用于编辑CD34+造血干细胞。

人类白细胞抗原基因分型方法分辨水平的专家共识

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因分型已广泛应用于造血干细胞捐献者资料库建立、供受者组织配型、血小板基因数据库建立以及疾病关联诊断、遗传学和其他科学研究。随着HLA等位基因数量的增加和分型技术发展,对于HLA基因分型分辨水平界定、供受者HLA位点结果描述和配合判定等存在一定差异,为提高对HLA基因分型分辨水平的界定和解读的规范性,HLA基因检测实验室和临床移植领域的多名专家,依据国内外相关文献和临床实践制定此专家共识,对国内HLA基因分型分辨水平的定义、分型方法、供受者结果描述和相合判定等进行了概述并达成共识,以期进一步规范实验室HLA基因分型,保障检测结果的准确性。

脐带血造血干细胞体外生成红细胞过程中高效脱核体系的研究

目的 研究磷脂酰肌醇三羟激酶(PI3K)、组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和细胞松弛素B对脐带血造血干细胞体外培养促红系脱核的作用,以期建立高效脱核体系。方法 采用磁分选富集脐带血CD34+细胞。在培养第0、4天添加干细胞因子(SCF)、IL-3、促红细胞生成素(EPO),培养第7天添加SCF、EPO,培养第11、15、18天仅添加EPO。分别于第7、11、15和18天添加PI3K(0、25、50、100 ng/mL)、HDAC2(0、60、150、300 ng/mL)、细胞松弛素B(0、25、50、75 ng/μL)3种脱核剂。采用正交设计实验分析3种脱核剂的浓度和添加时间4因素4水平对促红系脱核效果的影响,获得最佳脱核条件并作为优选组,以不加脱核剂培养作为对照组进行验证。细胞培养至第21天时,用流式细胞仪分别检测CD235+、SYTO-64-细胞,计算脱核率。使用血细胞计数仪检测RBC,ELISA法检测2,3-二磷酸甘油(2,3-DPG)、化学发光法检测ATP,观察细胞形态。结果 最佳脱核条件为培养第15天添加PI3K浓度为100 ng/mL、HDAC2浓度为150 ng/mL和松弛素B浓度为75 ng/μL。培养至第21天,优选组红细胞脱核率为(74.30±5.59)%,对照组为(28.30±14.10)%,优选组高于对照组(t=9.099,P=0.012)。培养体系获得RBC平均可达2×1010/L,红细胞ATP、2,3-DPG与正常红细胞无差异,红细胞形态与正常红细胞一致。结论 以上最佳脱核条件建立的培养体系可促进造血干细胞体外生成红细胞高效脱核。

浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

本研究的目的是分析浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性及基因型。采用序列特异性引物PCR法(PCRSSP)进行KIR基因低分辨率检测和基因型分析。结果表明:①在浙江汉族人群中共检出目前已知的17个KIR基因。2DL4、3DL2和3DL3基因存在于所有个体,其基因频率为1.00。2DL1、2DL3、2DP1、3DP1003、3DL1、2DS4001/002基因较为常见,频率分别为0.902、0.902、0.902、0.902、0.7598、0.5615;而2DL2、2DL5A、2DL5B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4003、2DS5、3DS1和3DP1001/002基因频率较低。②浙江汉族人群中以A型单倍型为主,频率高达74.7%。在检测样本中共明确检出12种单倍型,最常见的是单倍型2,频率为53.0%。③共检出26种基因型,最常见为AJ(2,2)、AF(1,2)型,其次为AH(2,5)、NN2(2,6)、AI(1,5)和AG(1,1)。其中有15种基因型在白人中尚未见报道,4种基因型无法根据相关文献标准分析出单倍型。结论:浙江汉族人群有其独特的KIR基因频率和基因型频率分布。

PCR-SSP法检测A^(1,2)BO^(1,2)血型基因型

目的 为了建立A1,2 BO1,2 血型系统基因分型的方法 ,以检测人群中A1、A2 、B、O1、O2 基因的频率。方法 采用盐析法进行样品DNA的抽提 ,采用PCR SSP法进行A1,2 BO1,2 血型基因分型。结果 15 8例中A1,2 BO1,2 系统基因频率分别是A1为 18 7% ,A2 为 0 6 % ,B为 17 4% ,O1为 6 2 3% ,O2 为 0 9%。结论 该方法可鉴定出A1,2 BO1,2 血型系统基因 ,中国人群中存在O2 基因。

大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其调控

本实验观察了基础培养条件和凝血酶刺激条件下，大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其信号传递途径。结果显示，基础条件下，Ａ２３１８７（４ｂｒｏｍｏｃａｌｃｉｕｍｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）和佛波醇脂（ｐｈｏｒｂｏｌ１２ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３ａｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）能明显提高星形胶质细胞组织因子活性的表达，而三氟吡啦嗪（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ，ＴＦＰ）和１（５异喹啉磺胺）３甲基哌嗪［１（５ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）３ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，Ｈ７］则降低星形胶质细胞组织因子活性的表达。凝血酶能明显增加星形胶质细胞表达组织因子活性；当凝血酶与ＴＦＰ或Ｈ７联合应用时，凝血酶的刺激作用受到明显抑制。实验表明，星形胶质细胞在基础培养条件下能表达组织因子，凝血酶能刺激它表达组织因子活性。Ｃａ２＋／钙调素和ＰＫＣ途径参与了在基础条件以及凝血酶刺激条件下星形胶质细胞组织因子活性的表达。

Jk(a-b-)表型分子机理的初步研究

目的 研究Jk(a-b - )表型的分子机理。方法 在标准血清学鉴定的基础上 ,对Jk(a -b - )表型进行第 4～ 11外显子及部分内含子DNA扩增 ,PCR产物经割胶纯化后直接进行测序分析。结果 Jk(a -b - )表型在第 5内含子 3’端拼接接受位点G突变为A ;第 3内含子 3’端第 78位A→G ;第 8内含子 5’端第 84位C→T ;外显子第 5 88位A→G(第 7外显子内 ) ;第 838位G→A(第 9外显子内 )。其中第 5内含子 3’端拼接接受位点G突变为A导致转录后外显子 6的缺失。结论 第 5内含子 3’端拼接接受位点的碱基G突变为A可能是Jk(a -b - )表型的分子遗传机理之一。

脂多糖、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α对乳鼠星形胶质细胞表达组织因子的影响

目的 :观察脂多糖、白介素 - 6和肿瘤坏死因子α对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响。方法 :培养Wistar乳鼠星形胶质细胞 ,细胞用抗神经胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体确认。细胞冻融液组织因子活性检测采用一期血浆复钙时间法。结果 :脂多糖、白介素 - 6和肿瘤坏死因子α组星形胶质细胞表达组织因子活性明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。脂多糖、白介素 - 6和肿瘤坏死因子α与三氟吡啦嗪 (TFP)或 1- (5 -异喹啉磺胺 ) - 3 -甲基哌嗪 (H7)联合运用 ,则它们的刺激作用受到明显抑制。结论 :脂多糖、白介素 - 6、肿瘤坏死因子能刺激星形胶质细胞表达组织因子活性 ,其机制可能与钙 /钙调素和蛋白激酶C途径有关。

血小板捐献者血型资料数据库的建设与应用展望

供受者血小板配合输注可有效解决免疫性血小板输注无效问题。由于受HLA和HPA基因系统多态性、人群中CD36抗原缺乏个体比例及临床应用需求时限性等因素的影响,需要提前建立有一定规模的血小板捐献者血型资料库,才可能在临床需要时及时提供配合性血小板。血小板捐献者血型资料库涉及HLA-A,-B基因型资料库、HPA基因型资料库和CD36抗原阴性资料库;国内部分血站已建立200—4 000(人)份捐献者血小板血型资料库。建库中献血者选择、HLA-C位点覆盖问题、HPA系统最适检测范围和检测方法选择仍有待标准化。血小板捐献者血型资料库具有良好的应用前景,但仍需要通过扩大血小板捐献者基因型资料库规模、缩短配合血小板制备发放流程所需时间和加强临床沟通等措施,来提升基因型配合血小板的临床应用。

HLA检测技术及其应用的研究进展

人类白细胞抗原(HLA)基因检测技术已应用于造血干细胞移植供受者选择、药物个性化治疗、群体遗传多态性和某些疾病关联的研究等方面。近年来国内外HLA研究取得一系列进展包括:升级了《常见及确认的HLA等位基因表》,新一代测序平台应用于HLA基因分型;发现在HLA错配和单体型造血干细胞移植前宜做供者HLA特异性抗体检测;HLA基因与某些药物引发的严重不良反应密切相关,HLA-C区域上游35 kb的1个SNP位点(rs9264942-35C/T)与HLA-C表达水平和个体HIV感染后的病毒载量水平有关;与Hsa-miR-148a结合的HLA-C 3'端非编码区域内的碱基变异可调节HLA-C mRNA的表达。HLA表达沉默的巨核细胞和血小板,可逃避HLA抗体介导的细胞毒性反应,有助于解决血小板输注无效问题。

人类白细胞抗原系统分型技术及其应用的现状分析和展望

人类白细胞抗原(HLA)在移植免疫、人类遗传学、疾病关联、药物组学、输血医学等领域中发挥重要的作用。下一代测序(NGS)技术已应用于HLA基因分型,不同分型策略和结果指定信息系统的分型准确率存在差异。已公布的中国人群HLA常见等位基因和确认等位基因,存在明显的人群分布特点,可作为国内HLA基因分型指定的参考标准。供者特异性抗-HLA在实体器官移植、造血干细胞移植中具有重要的作用,准确鉴定出这种抗体有助于提升移植患者存活率。HLA、MICA和KIR与疾病关联研究中大部分报道病例数较低,今后需要多中心合作的大样本分析。血站系统HLA实验室多数已具有高分辨分型能力,但发展存在不均衡现象,整体上规模偏小。国内初步建立了血小板捐献者HLA基因型数据库,其库容量的扩展可与中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)的发展协同规划。

电液数字伺服双缸同步控制系统

大型机械臂等液压执行元件在驱动过程中由于力平衡和结构等方面的原因,对同步控制的精度和响应速度要求较高。为消除磁滞、饱和等非线性因素的影响,采用一种新型的电液数字伺服阀构成位置同步闭环系统,该阀具有结构简单、抗污染能力强、可实现计算机直接控制等优点。对系统进行了数学建模和理论仿真,并得到实验结果。表明该同步系统具有响应速度快,控制精度高的优点,其同步误差控制在0.05mm以内。

HLA相合亲缘供受者自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的分析

本研究分析HLA相合亲缘关系供受者自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因分布情况并探讨其KIR相合的可能性。采用Luminex流式技术和测序方法检测HLA-A,-B,-Cw和-DRB1位点;利用序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)检测KIR基因。结果表明:在HLA-A,-B,-Cw和-DRB1等8个位点相合的27对亲缘关系供受者样本中检出17个KIR基因,其中KIR3DL3、KIR3DP1、KIR2DL4和KIR3DL2基因存在于所有个体;检出20种KIR基因型和12种单倍体,常见基因型为2,2,频率为29.6%;最常见单倍体是2,频率为53.0%,样本以A型单倍体为主,频率为67.2%;12对(44.4%)供者KIR与受者KIR基因型和单倍体完全相同,13对(48.1%)供者KIR与受者KIR存在1个单倍体相同,2对(7.4%)供者KIR与受者KIR基因型和单倍体完全不同;1对供者KIR2DL1与受者HLA-Cw(Lys80)配基完全相合,17对供者KIR2DL2/2DL3与受者HLA-Cw(Asn80)配基完全相合,5对供者KIR3DL1与受者HLA-B(Bw4)配基完全相合。结论:HLA相合亲缘关系供受者KIR匹配的错配率比较高。

血小板配合性输注的分析和展望

血小板配合性输注可有效解决免疫性血小板输注无效(PTR)并节约血小板资源、提升血液安全性。本文对血小板配合性输注中的HLA、HPA和CD36配合性方式,HLA抗体效价和抗原免疫原性以及血小板配合性输注发展作了述评和展望。HLA配合性方式涉及等位基因、抗原、表位水平的配合以及规避供者特异性抗体(DSA)对应抗原的策略,需要探索的是设定规避DSA强度(MFI)的阈值。PTR患者可检出HLA等位基因特异性抗体,因此患者和献血者HLA-A、-B位点宜做高分辨水平的基因分型,以规避相应特异性的抗-HLA。HLA-A、-B位点不同抗原或表位的免疫原性存在差异,选择抗原低表达或免疫原性低的献血者血小板或成为1种相容性配合方式。不同人群抗-HPA产生的概率和种类不同,HPA配合性方式有等位基因的配合和规避抗体对应抗原的配合。CD36配合性方式为规避抗体对应抗原的配合,原则上优先选择CD36抗原Ⅰ型缺失的献血者,次选CD36抗原Ⅱ型缺失的献血者。今后在血小板配合性输注中,应关注供者血小板基因库的库容量提升和信息化建设;在库存和待检血小板检索和配合,将会明显缩短血小板配合性输注所需时间。

PCR-SSP方法检测Scianna血型基因型

目的 建立Scianna血型基因型检测方法,了解人群Scianna血型基因型的分布情况。方法 对240份浙 江汉族人及100份新疆塔吉克族人全血标本采用盐析法抽提DNA,PCR SSP做Scianna血型基因型分型方法。结果 在检测的浙江汉族和新疆塔吉克族人体,Scianna血型分型均为Sc:1, 2基因型,Sc1等位基因频率为100%,未 检测到Sc2等位基因。结论 PCR SSP分型方法用于血型基因型检测简单可行。

凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制

目的 :观察凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制。方法 :培养Wistar乳鼠星形胶质细胞 ,细胞用抗神经胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体确认。细胞冻融液组织因子活性检测采用一期血浆复钙时间法。结果 :与对照组比较 ,凝血酶使星形胶质细胞组织因子表达明显增高 (P <0 .0 5 )。当凝血酶与三氟吡啦嗪或H7联用时 ,它对星形胶质细胞表达组织因子活性的刺激作用受到抑制。与凝血酶组比较 ,已酮可可碱十凝血酶组星形胶质细胞组织因子活性表达明显下降。结论 :凝血酶能刺激星形胶质细胞表达组织因子活性 ,三氟吡啦嗪、H7、己酮可可碱可抑制凝血酶的这种刺激作用。

PCR检测Rh血型C/c基因型

目的 建立Rh血型系统C/c基因分型的方法 ,检测人群中C/c基因频率。方法 用快速盐析法抽提样本DNA ,用PCR检测C/c基因型。结果 本组RhD阳性人群中 ,C基因型频率为 0 6 74,c基因型频率为 0 32 6。RhD阴性人群中 ,C基因频率为 0 2 34 ,c基因频率为 0 76 6。结论 RhD阳性与阴性人群C和c基因频率存在明显的差异。RhD阳性人群以C为主 ,RhD阴性人群中以c为主。

序列特异性引物PCR法检测Rh血型E/e基因型

目的 建立 Rh血型 E/e基因分型的方法 ,以检测人群中 E/e基因频率。 方法 采用快速盐析法抽提样本DNA,采用 PCR-SSP方法检测 E/e基因。 结果 在本研究的 Rh D阳性人群中 E基因频率为 0 .2 2 3 ,e基因频率为 0 .777。Rh D阴性人群中 E基因频率为 0 .0 40 ,e基因频率为 0 .960。 结论 人群中以 e基因为主 ,Rh阳性与阴性人群中 E和 e基因频率存在明显的差异。