肿瘤抗原肽的HLA限制性确认和诱导反应性T细胞杀瘤能力评估

目的了解肿瘤抗原肽的HLA限制性以及其诱导的T细胞能否杀伤肿瘤细胞,探索无关供者来源细胞用于过继性抗肿瘤T细胞治疗。方法使用16个肿瘤抗原肽诱导18名无关供者外周血单个核细胞(PBMC)分化为反应性T细胞,并分析HLA型别;利用NetMHC数据库预测肽和HLA分子亲和力;选择HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽诱导第二组17名无关供者的PBMC进行杀瘤实验,反应性T细胞作为效应细胞,T2细胞及肿瘤抗原肽同源的肿瘤细胞作为靶细胞,测量LDH(乳酸脱氢酶)释放量或者RTCA(实时无标记细胞分析仪)检测效应细胞杀瘤效率,比较HLA-A2+和A2-T细胞杀瘤效率。结果筛出和HLA-A2具有高亲和力的肿瘤抗原肽LM7,可诱导5/11 HLA-A2+为反应性T细胞,其中HLA-A2+纯合子则为3/3,而HLA-A2-者则为2/7。LM7诱导反应性T细胞杀伤肿瘤百分比A2+组明显强于A2-组(60.72±11.28 vs 47.2±4.46,P=0.03)。结论本研究显示NetMHC预测对于纯合子样品更有帮助,肿瘤抗原肽LM7具有HLA-A2限制性,可诱导部分HLAA2+PBMC分化为反应性T细胞,可杀伤肿瘤,应对供者进行HLA筛选并分析其细胞功能,其诱导的反应性T细胞可作为过继性T细胞抗肿瘤治疗的细胞来源。

NLRP3炎性小体对THP-1细胞吞噬老化红细胞后亚类分化的调控

目的明确NLRP3炎性小体是否可调节巨噬细胞对红细胞的吞噬能力,调控巨噬细胞的亚类分化。方法以NLRP3低表达的THP-1细胞(ID3 THP-1),转空载体的THP-1细胞(shNC THP-1)及野生型THP-1细胞模拟巨噬细胞,与未处理红细胞、水浴老化红细胞、IgG致敏红细胞分别孵育。流式细胞术检测THP-1细胞对不同红细胞的吞噬率;流式细胞术检测巨噬细胞M1亚类指标CD16和CD86,M2亚类指标CD163和CD206在THP-1细胞上的表达。结果NLRP3低表达的ID3 THP-1对红细胞的吞噬能力明显下调。老化红细胞具有诱导THP-1向M1亚类分化,抑制THP-1向M2亚类分化的能力。当THP-1的NLRP3炎性小体表达下降时,吞噬红细胞后,其向M1亚类分化的能力下调,而向M2亚类分化的能力增强。结论NLRP3炎性小体可作为一个靶向调节位点,调控巨噬细胞对红细胞吞噬,及其自身的亚类分化。

输血医学中免疫血液学检测技术与理念的创新

为了克服传统血型血清学实验检测体系中存在的弱点,一系列新技术包括柱凝集、人工合成糖链和可溶性的血型抗原重组蛋白等技术在近几年应运而生。血型基因诊断的技术也在不断地发展,为基于抗体诊断的血清学提供了许多额外的信息。但是体外试管中的凝集并不完全反映血液输入后患者体内的免疫应答,影响患者对血型抗原免疫应答的因素还包括患者的遗传背景及与微生物的接触史,以及供受者之间非表位多态性的匹配程度。

用p[Tj(a-)]外周血淋巴细胞建立抗-PP1P^(k)杂交瘤细胞株

目的建立分泌抗-PP1P^(k)(又称抗-Tj^(a))的淋巴母细胞样细胞系(lymphoblastoid cell line,LCL)和单克隆杂交瘤细胞株。方法无菌条件下常规方法制备p[Tj(a-)]血型献血者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)转化单个核细胞中的B淋巴细胞,使其增殖形成B淋巴母细胞样细胞克隆。用菠萝酶处理的正常AB型和O型红细胞以及p[Tj(a-)]红细胞筛选培养上清,通过显微吸引分离技术获得分泌特异性抗-PP1P^(k)的LCL,与SHM-D33骨髓瘤细胞进行融合。异源杂交瘤细胞经次黄嘌呤(H)-氨基蝶呤(A)-胸腺嘧啶(T)-脱氧胞嘧啶核苷(D)-毒毛旋花苷(O)即HOTD培养基选择性培养、抗体筛选以及有限稀释亚克隆,建立分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。结果从O型p[Tj(a-)]献血者外周血B淋巴细胞EBV转化细胞培养上清中,初筛得到与正常红细胞全部凝集,与p[Tj(a-)]红细胞不凝集的单个淋巴母细胞样克隆5E1-E5,初步鉴定培养上清具有抗-PP1P^(k)特异性。随后利用杂交瘤技术,将5E1-E5细胞与SHM-D33骨髓瘤细胞进行融合,建立了持续稳定分泌IgM抗-PP1P^(k)的单克隆杂交瘤细胞株。结论本研究通过EBV转化和杂交瘤技术建立了分泌抗-PP1P^(k)的人单克隆细胞株,这项工作使大规模筛选稀有p[Tj(a-)]血型成为可能,对我国稀有血型库的建设具有重要意义。

上海地区部分人群Jk(a-b-)、Di^b-、Wr^b-、K_0、Ena-、Tja-、Ge-稀有血型筛选

目的 了解上海地区人群中部分稀有血型的分布 ,以解决临床稀有血型用血问题。方法 采用 2M尿素对受检红细胞进行Kidd血型系统的Jk(a -b - )表型筛选 ;利用稀有单克隆、多克隆抗血清 ,对Diego血型系统的Dib-、Wrb- ,Kell血型系统的K、K0 ,MNS血型系统的Ena - ,P血型系统的Tja - ,Miltinberger血型系统的Murf,Gerbich血型系统的Ge -进行筛选。筛选方法采用试管法间接抗人球蛋白试验 (IAT) ,U型 96孔微量板IAT和盐水直接离心法试验。结果 在 6 4 5人中筛选到Di(a +b - ) 1例 ,90 0人中筛选到Mur(+) 6例 ,10 0 5 7人中筛选到K(+) 7例 ,4 84 0 0人中筛选到Jk(a -b - ) 2例 ,而在 4 0 0 0人的筛选中未发现Wrb-、K0 、Ge -和Ena -表型。结论 上海地区人群中Dib-、Mur+、Jk(a-b - )的红细胞表型明显高于白种人和黑人。

红细胞稀有血型筛选、建库与应用

目的通过在献血者中筛选稀有血型,获得针对高频血型抗原组表达阴性的稀有表型,解决临床稀有血型血液供应困难的难题。方法在国家"十一.五"和"十二.五"计划项目中,通过国內13个省级血液中心的联合,利用血型血清学方法和分子生物学方法,我们开展了针对Duffy,Kell,Kidd,MNS,Gerbich,Diego,Yt,Lutheran,Col-ton,Ok以及ABO,Rh血型系统中高频抗原的筛选。在血清学筛选试验中,釆用了适应于高通量的微量板法和改良的抗球蛋白法。这些方法在简化经典的间接抗蛋白试验的同时,又适用于血型自动化检测的需术。在这些血型系统稀有血型筛选中,有10多种稀有血型是通过筛选稀有等位基因的方法来完成的。通过组建多个多重PCR体系,我们成功地完成了针对k,s,Fy(a-),Co(a-),Yt(a-),Di(b-),Kp(c-),Kp(b-),Js(b-),Ok(a-)稀有等位基因的检测。由于单个实验室通常无法同时获各类稀有表型DNA作为分子诊断的实验对照,我们采用了定点诱变技术(SDM),通过环状诱变PCR方法,制备了各种稀有表型等位基因突变点片段,以用于分子生物学方法筛选稀有血型的对照。结果在2008～2010年期间,参于项目的各单位共筛选献血者稀有血型135多万人次。其中北京、上海、广州、天津、武汉、浙江、江苏、成都血液中心筛选汉族献血者130万人次,新彊、内蒙、广西、昆明血液中心筛选少数民族献血者5万多人次。共获得各类稀有血型1 000多例。其中包括极为罕见的Ko、Rhnull、Wr(b-)等稀有表型。众多新的血型等位基因和存于中国人群中的特殊遗传模式被发现。同时,也首次在中国人群中发现Yt(a-),Co(a-),Lu(a-b-)等稀有表型。2011年1月,中国稀有血型专业网站开通,通过信息发布、在线查询和BBS论坛讨论,进一步有益于稀有血型的信息交流与技术的推广。在最近2年的临床稀有血型输血应用中,共有>4 000 ml的稀有血液被用于临床抢救与治疗。结论开展稀有血型筛选并建立全国性的稀有血型信息网络对解决临床稀有血型输注困难是有效的途径。扩大筛选的范围与增加筛选与验证的体系有助于中国稀有血型库的壮大。

人不是熊猫 人血不是熊猫血

ABO和Rh是人类众多血型系统中最具临床意义的两种。RhD(-)在中国汉族人群中相对较少(0.4%),社会上有人将RhD(-)血型称为"熊猫血",暗示有RhD(-)血型的血液特别珍贵,RhD(-)血型的伤患者只能输RhD(-)的血液,而RhD(-)血型的献血者最好平时不要献血,要留到需要的"关键时刻"才献血的错误观点.本文通过血型与稀有血型的定义,从遗传学与临床病理学的角度,分析了RhD(-)产生的原因、频率与临床需求量。并通过介绍血液的招募、采集、化验、制备、发放的整个过程以及献血伦理规范,论述了对RhD(-)常见的误解和不合理宣传。本文提倡,健康适龄的RhD(-)人士像其他血型的献血者一样,定期规律地参加无偿献血,这是保证RhD(-)血源合理库存、进而使RhD(-)患者的输血需求能及时得到满足的基本途径。

多重聚合酶链反应分析中国汉族人群RHD基因

目的 分析中国汉族人群 RHD基因的构成。 方法 采用 2套多重 PCR-SSP扩增体系 ,对 45 0例献血者 (3 2 8例 Rh D阳性、1 1 2例 Rh D阴性、1 0例 D变异型 )的基因组 DNA进行 RHD特异性外显子 3、4、5、6、7、9和内含子 4,RHDΨ及C、c等位基因扩增 ,并与血清学 Rh定型结果进行对比。 结果 3 2 8例 Rh D阳性献血者中 ,3 2 6例具有全部的 RHD基因特异性外显子 ,另有 2例分别为 DVa和 DIVb;1 1 2例血清学 Rh D阴性献血者中 ,3 5例存在全部的 RHD基因特异性外显子 (3 1 .2 5 % ) ,但该 3 5例样本中未检出 RHDΨ基因 3 7bp的插入片段。 1 0例 D变异型中 3例为 D ,1例 DVa,1例 RHar0 ,1例DDFR;另外 4例中 ,2例缺乏 RHD所有特异性外显子 ,2例扩增出 RHD所有特异性外显子。 结论 中国汉族人群 RHD基因的表达存在多种模式。多重 PCR体系分析 RHD基因既可诊断个体的 Rh D表型 ,又具有确认不完全 D以及发现新的

环磷酰胺抑制作用下小鼠对人红细胞抗原的选择性耐受

目的 以环磷酰胺 (CY)作为免疫抑制剂 ,诱导小鼠产生对人红细胞血型抗原的选择性免疫耐受。 方法 1 0 2只 Balb/c小鼠分成 1 7组 ,在 2× 1 0 7人红细胞免疫注射后 ,分别以不同 CY剂量和给药时间给予抑制。并通过直接和间接血凝反应测定小鼠免疫应答所产生的抗人红细胞抗原的 Ig M和 Ig G型抗体效价。 结果 在 5 0～ 1 5 0 mg/kg CY剂量范围内 ,免疫注射当天至免疫后第 4天 (d0～d4)均可对小鼠的免疫应答产生抑制。而诱导小鼠产生对人红细胞抗原完全耐受的最佳 CY抑制时间和剂量分别为免疫注射后的第 1天和 1 0 0 mg/kg。 结论 CY能有效抑制小鼠对人红细胞免疫所产生的应答 ,选择适当的给药时间和 CY剂量对耐受的建立十分重要。本项研究对诱导小鼠免疫系统产生对人红细胞血型弱抗原的应答具有探索意义。

IgG抗-D的温和还原与修饰

IgG性质的抗D抗体由于其分子的两个Fab端之间的距离小于红细胞在盐水介质中可达到的最小间距,而无法使具有相应抗原的红细胞在盐水介质中产生肉眼可见的凝集。有许多方法,诸如用酶或胶体改变红细胞表面的性质;或用高速离心。

RhD抗原的鉴定 我们该做的多深入

RhD抗原是最具有免疫原性的血型抗原。正常RhD阳性表型红细胞表面有10000~30000个D抗原位点[1],每个D抗原决定簇由三十多个D表位组成[2]。D抗原数量表达下调,或部分D表位缺失的红细胞,被称为D变异型（Dvariants）。目前,D变异型可分为两个亚类：

红细胞血型抗原的同种免疫

虽然产生血型抗原同种免疫应答的首要因素是输入不相合抗原的免疫能力,但并非所有抗原不相合的输血都能诱导出血型同种抗体。每位患者都具有一组独特的基因,并处于一种或多种不同的疾病状态。特定的HLA-Ⅱ分子表达可能对患者是否产生应答起到了一定的影响。目前有一部分导致红细胞同种免疫反应的临床和生物学因素已得到了阐明,包括微生物中与血型抗原同源的短肽和血型分子非外表多态性对免疫反应的影响,脾脏中边缘区B细胞和特定树突状细胞亚群在输血反应中发挥的关键作用,以及由血型抗体诱导的抗原丢失所产生的免疫抑制。通过小鼠模型,研究者们探索了控制同种免疫反应的部分机制,这些知识将有助于识别最有可能对红细胞抗原产生免疫反应的患者,从而可以实施适当的资源和策略来预防输血诱导的同种免疫,或减轻其有害影响。

免疫性输血反应的调查及预防研究

目的 对各类输血反应进行调查研究 ,同时建立输血前免疫血液学检查新技术 ,以预防和治疗免疫性输血反应。方法 对上海地区 13家医院的 30 776名输血病人进行调查 ,并应用改良Polybrene、简易致敏红细胞血小板血清学试验 (SEPSA)等新技术 ,进行同种特异性抗体的筛选、鉴定及交叉配型试验。结果 发生各类输血反应5 0 8例 (1.6 5 % ) ,其中检出引起免疫性输血反应的同种抗体 6 4例 (12 .6 % ) ,抗体特异性分别为血小板抗体 (包括HLA) 5 1例 ,红细胞不规则抗体 13例 ;各项新技术的应用对预防免疫性输血反应的发生具有显著相关性 (χ2 >3.84 ,P <0 .0 5 )。结论 使用研究建立的输血前免疫血液学新技术能有效地诊断、预防和治疗免疫性输血反应的发生 。

中国汉族人群检出新的B(A)641T>C等位基因

目的明确稀有ABO表现型的遗传学基础。方法对ABO血清学常规定型正反不一致的样本,采用PCR-RFLP方法作初步基因分型,对8例血清学表现为AwB,而基因分型具有O基因的个体,进行ABO基因第6和7外显子PCR产物的TA克隆及核苷酸序列测定。结果8例样本除1对为母女关系外,其余无任何亲缘关系,血清学表现相似,红细胞上含有接近正常的B抗原和少量A抗原,H抗原含量较正常B细胞显著增高,血清中存在抗-A,初定为AwB,基因分型均为BO。克隆测序表明除具有正常O1或者O1V基因外,他们的B基因第7外显子在正常B等位基因的基础上,均发生单碱基突变,4例发生nt700C>G点突变,导致Pro234Ala,2例无关个体为nt640A>G点突变,导致Met214Val,1对母女均表现nt641T>C点突变,导致Met214Thr。证实所有8例样本真正血型应为B(A)表现型,其基因型均为B(A)/O型。结论在中国汉族人群中检出3种B(A)血型,除了已在我国台湾首先被发现的B(A)700C>G和笔者以前报道的B(A)640A>G之外,新发现1种B(A)641T>C等位基因。

广西侗族人群稀有血型Mur抗原的调查研究

目的:了解广西侗族人群Mur稀有血型抗原的频率,更好的指导本地区的临床输血。方法:对检测人群严格入选标准,采用试管法进行Mur+筛选。结果:844名广西侗族人群筛选出Mur+130人,频率为15.4%,其阳性率明显高于我国上海及广东番禺地区,低于云南怒族人群。结论:Mur稀有血型抗原的阳性率在不同地区及各民族之间存在着较大的差异。

220例患者血型不规则抗体分析

目的 对上海地区患者中不规则抗体检出情况进行回顾性总结。方法 对 2 0 0 0年以来上海各医院送检的免疫血液学标本 2 1 49例 ,应用盐水、抗球蛋白法、聚凝胺法检测不规则抗体。结果 共鉴定确认血型不规则抗体 2 2 0例。其中自身抗体 66例、确定同种特异性抗体 1 5 4例 ,分别为 :抗 -D41例、抗 -E3 7例、抗 -c E1 9例、抗 -Ce4例、抗 -CD3例、抗 -c4例、抗 -M 1 5例、抗 -N 3例、抗 -P1 2例、抗 -Lea 1例、抗 -Leb 4例、抗 -Lex 1例、抗 -Mur 3例、抗 -S 2例、抗 -HI 1 1例、抗 -Jkb 1例、抗 -Fyb 1例、抗 -Tja1例、抗 -I1例。结论 检出的不规则抗体与国外数据存在较大差异 ,国外常见的抗 -K、抗 -Fya 在国内较少见。产生抗体的患者 (不包括孕妇 )以女性居多。

上海地区部分献血者中抗D发生频率及对输血的影响

Ｒｈ血型对输血的影响，主要来自一部分Ｒｈｏ（Ｄ）阴性个体，他们通过输血或妊娠的免疫作用产生了抗Ｄ抗体，在输入不配合的Ｒｈｏ（Ｄ）阳性血后，轻者发生迟发性溶血性输血反应，重者引起急性输血反应甚至死亡。阴性个体及其发生抗Ｄ的频率在不同的人种和民族中存在着...

上海地区人群中部分稀有血型筛选

目的了解上海地区人群中部分稀有血型的频率和分布情况,用于解决临床上稀有血型的用血问题。方法利用稀有单克隆、多克隆抗血清,对Kell血型系统的K0,Miltenberger血型系统的Mur+,Duffy血型系统的Fya-,高频率抗原中的Lan-、Vel-进行筛选;用2 mol/L尿素进行Kidd血型系统的Jk(a-b-)表型筛选。筛选方法包括试管法间接抗人球蛋白试验(IAT),U型96孔微量板IAT和U型96孔微量板盐水直接离心法试验。结果从24 093名献血者中发现1例K0表型;在2 970名献血者中检出15例Mur+;从200名献血中,检出1例Fya-;从6 153名献血者中发现2例Vel-;在300名献血者中发现了1例Lan-;在102 760名献血者中,成功检出4例Jk(a-b-)。结论Mur+、Lan-、Jk(a-b-)表型频率明显高于白种人;Fya-表型频率低于白种人。

Ax亚型的分子生物学研究

目的 研究中国汉族人群Ax亚型的分子生物学特点。方法 首先采用双重PCR RLFP方法 ,对 8份血清学试验疑为Ax及AxB的标本 ,做ABO初步基因分型 ,明确其中的A、B或O基因 ;然后用限制性内切酶mobI筛选ABO基因第 7外显子中的T6 4 6A的突变。对不具有该突变而血清学疑为Ax的标本以及血清学和基因分型不一致的标本 ,则进一步对其ABO基因第 6和 7外显子做深入的克隆测序分析。结果 8份标本中有半数含有T6 4 6A点突变 ,剩余 4份中 ,1份为包含C4 0 7T和C4 6 7T错义突变的A weak 0 1等位基因 ,1份为携带新的核苷酸变异的Ax (C4 6 7T和C74 5T)等位基因 ,另外 2份血清学疑为AxB ,初步基因分型为BO的个体 ,克隆测序的结果显示两者均有正常的O基因 ,但是其B等位基因均发生了新的nt6 4 0位A G突变。结论 在中国汉族人群中检测到新的Ax及B(A)