PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。

PCV4 Cap抗体ELISA检测方法的建立及血清流行病学调查

旨在建立一种猪圆环病毒4(porcine circovirus type 4, PCV4)Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法,对猪群中PCV4抗体进行检测,并与以往的关于PCV4血清流行病学的调查结果进行对比研究,从而更全面地了解PCV4在猪群中的感染和流行情况。本研究利用原核表达系统成功表达PCV4 Cap蛋白,对反应条件进行优化,建立了基于PCV4 Cap蛋白的间接ELISA方法。采用建立的ELISA方法对中国18个省份的不同阶段的2 298份猪血清样本进行检测,以调查中国猪群中PCV4的血清学流行情况。同时将Cap-ELISA检测方法与之前建立的Rep-ELISA进行对比,平行检测845份血清样本。结果显示,在18个省份中,17个省的血清样本中检测到PCV4抗体。PCV4总血清阳性率为34.94%,母猪和育肥猪阳性率分别为59.95%和31.64%,仔猪阳性率为21.14%,保育猪中检出的阳性率最低,为4.20%。两种方法共同检测845份血清样本,符合率为82.84%,其中Cap-ELISA检测总阳性率为31.83%,Rep-ELISA检测总阳性率为35.03%。研究表明,PCV4在中国广泛传播,不同年龄阶段的猪只均能感染。Cap-ELISA和Rep-ELISA两种方法一致性高,从抗体消长规律来分析,两种方法都说明猪群感染PCV4主要在育肥猪和母猪阶段。本研究提供了中国PCV4的最新血清流行病学特征和PCV4在不同阶段猪群中的感染情况,进一步证实了PCV4在我国猪群中有一定的感染率,其危害值得进一步研究和关注。

不同疫苗接种对商品猪群感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

为评价不同免疫方案对商品猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的防控效果,在一规模化猪场选取240头未经PRRS疫苗免疫且无PRRSV感染的断奶仔猪分成3组,组内包含15头耳牌跟踪猪。其中混合免疫组、弱毒疫苗组在25 d免疫PRRS经典毒株弱毒疫苗,混合免疫组在50 d免疫PRRS经典毒株灭活疫苗;对照组不接种PRRS疫苗。试验前称重并记录各组耗料情况,于44 d(首免后20 d)或猪群出现PRRSV感染后每隔10 d采血监测PRRSV病毒血症以及抗体产生情况,试验后称取各组试验猪重量。结果显示,2个组猪在首免后抗体出现上升,于99 d(二免后49 d)猪群产生了较高的抗体水平,并持续到试验结束。而混合免疫组在二免后20 d,对照组在69 d监测到有猪开始出现PRRSV病毒血症,弱毒疫苗组于89 d发现有猪出现病毒血症。表明对试验猪免疫1次PRRS弱毒疫苗,可显著降低猪只感染PRRSV后的病毒血症几率,以及病毒血症持续时间;与未接种疫苗的猪相比,接种PRRS疫苗的猪在料肉比方面没有表现出明显的差异;接种该弱毒疫苗免疫25 d的基础上,加免1针灭活疫苗没有显示出明显优势。

4种猪伪狂犬病病毒活疫苗免疫效果对比分析试验

试验旨在筛选不同免疫效果的猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗,选取60日龄的健康仔猪60头,分成4组,分别接种A、B、C、D4种PRV弱毒活疫苗,4种疫苗每头份所含病毒滴度从高到低排序为C、D、B、A,定期采血检测血清抗体(gB、gE)水平,以评估其免疫效果。结果表明:当保育猪的母源抗体S/N值高于0.90时,首次接种PRV活疫苗能产生抗体上升反应;在仔猪63、98和130日龄时,分别接种PRV活疫苗,C疫苗所产生gB抗体的效果比免疫A疫苗或B疫苗或D疫苗更好;针对生长育肥猪,最好选择接种3次PRV活疫苗,以确保猪只获得较为充分的保护。

规模猪场猪轮状病毒优势毒株及感染情况调查

为调查猪场猪轮状病毒(PoRVA)流行毒株以及不同阶段猪群PoRVA感染情况,从某规模猪场收集PoRVA阳性样本进行VP7基因测序分析,同时采集不同阶段猪群粪便样本,采用荧光定量RT-PCR方法进行PoRVA检测,分析猪场不同阶段猪群PoRVA感染情况。结果发现:该规模猪场PoRVA流行毒株主要为G9型猪轮状病毒;各阶段猪群粪便样,其阳性率介于1.5%~42.09%,其中7~23日龄哺乳仔猪粪便样,阳性率为8.66%,24~65日龄保育猪粪便样,阳性率为42.09%,育肥猪阳性率为2.66%,母猪为1.5%;从24~42日龄临床正常(55.08%)与腹泻猪(36%)之间的PoRVA阳性率比较结果,没有发现腹泻与感染PoRVA存在相关性。

五种常用猪2型圆环病毒疫苗的效果比较与分析

为了比较不同厂家疫苗对圆环病毒2d亚型(PCV2d)的防控效果,试验将相同批次的28 d龄断奶仔猪525头,分成5组,每组105头,分别接种A、B、C、D和E五个厂家的PCV2疫苗。免疫前从每个组中挑选15头断奶仔猪,采血监测PCV2抗体,根据抗体结果再将小猪均衡调配至各疫苗组并标记为后续跟踪监测对象,于60、88、97、107、117、127、137、149、158和181 d龄进行采血监测PCV2感染情况。试验前称取并记录各组猪只的重量,试验期间记录猪只的死淘情况和饲料消耗量,试验后再次称重并计算日增重和料重比。结果显示:感染后各时间点血液PCV2抗原的阳性率整体上,疫苗D组>疫苗A组>疫苗E组>疫苗B组>疫苗C组;死淘率和料重比,疫苗C组<各疫苗组;日增重,疫苗C组>各疫苗组;疫苗C组猪只的血液PCV2抗原阳性率低、病毒血症维持时间短、死淘率低(8.57%)、日增重高(0.738 kg/d)、料重比低(2.644)。说明疫苗C相较其他厂家的疫苗效果更好,更能有效防控PCV2d型毒株的感染。

屠宰猪猪肺炎支原体P36、P46、P97 R1、P146氨基酸序列的差异分析

为了解猪肺炎支原体流行菌株遗传变异情况,选取2014-2017年不同时间、地点收集的17头猪肺炎支原体阳性屠宰猪肺脏灌洗液DNA为模板,进行猪肺炎支原体P36(编码具有强免疫原性的胞浆蛋白)、P46(编码具有强免疫原性的表面蛋白)、P97 R1区、P146高变区(猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的重要功能区域)基因的PCR扩增、测序。结合GenBank登录的猪肺炎支原体相关序列进行氨基酸序列的比对分析。结果表明,比对的序列之间,P36、P46蛋白氨基酸序列同源性均在98.9%以上,但P97功能区R1区、P146多变区在菌株间存在较大差异。11个屠宰猪样本和5个GenBank登录菌株P97 R1区重复氨基酸序列数量达到14个以上,而GenBank登录的3个疫苗相关菌株(168株、168-L株、J株)及另外4个菌株、4个屠宰猪样本重复序列为9～11个不等;P146高变区氨基酸序列的差异主要集中在2个重复氨基酸序列区(R1、R2),GenBank登录的168株、168-L株、J株以及另外2个菌株,1个屠宰猪样本在R1区出现较多氨基酸缺失。168株、168-L株,6个屠宰猪样本及另外3个GenBank登录菌株在R2区出现了3～9个不等的氨基酸缺失。利用DNAStar进行抗原表位预测发现,菌株间P97 R1、P146 R1、P146 R2区氨基酸序列的差异,导致了抗原表位出现明显的变化。提示开展P97、P146等黏附因子的筛选和研究或许能进一步提升疫苗阻止猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的作用,从而进一步改善疫苗的免疫效果。

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.

不同厂家PEDV-IgA抗体ELISA检测试剂盒的对比分析

为比较市面上常用PEDV-IgA抗体ELISA试剂盒检测结果之间的相关性,挑选不同厂家生产的3款试剂盒检测了68份母猪初乳及78份免疫前后的后备母猪血清,并对检测结果进行了相关性分析。结果表明:不同试剂盒检测初乳和血清PEDV-IgA抗体结果差异较大,在进行实验室检测时,应注意合理选择试剂盒,并科学地分析和利用实验室检测结果。

生猪猪衣原体感染的PCR诊断

衣原体是介于细菌和病毒之间的一种微生物,猪衣原体可引起生猪结膜炎、肠炎和肺炎。2015年4月湖南省益阳某规模猪场,约40%的120-160日龄育肥猪出现眼结膜发红、流泪等症状,笔者采用PCR方法检测了6份鼻拭子和2份眼睛分泌物拭子,并进行了药物防治,报告如下。

努比亚山羊巴氏杆菌羊创伤球菌混合感染的诊治

巴氏杆菌属为无芽孢,不运动,兼性厌氧,菌体两端常染色浓重的革兰阴性小杆菌。本属已确定的种有多杀巴氏杆菌、嗜肺巴氏杆菌、溶血巴氏杆菌、尿巴氏杆菌和鸭疫巴氏杆菌等。在猪、牛[1]、羊[2]等动物常有巴氏杆菌感染的报道。创伤球菌属是1993年Collins等提议设立的一个菌属,目前该属的主要成员有孔兹创伤球菌、羊创伤球菌、瑞典创伤球菌和化脓创伤球菌。只有羊创伤球菌分离自动物,其他均分离自人的临床样品。

一例猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株感染的实验室诊断报告

本实验通过免疫学和分子生物学的方法,对湖南省浏阳市某疫区猪场是否存在猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)变异株感染进行了确诊,并对该病的诊断和防控做出了讨论。

规模猪场母猪群猪瘟抗体监测与补苗效果分析

为了解规模猪场母猪群猪瘟抗体情况,评价猪瘟疫苗加强免疫的效果。对2个规模猪场的母猪群进行了猪瘟抗体检测、补苗、再检测、再补苗的过程。结果表明母猪群通过科学的增加猪瘟疫苗接种能明显提升猪瘟抗体水平,但2个猪场的母猪群中均有少数母猪通过反复接种疫苗仍不能产生较好的猪瘟抗体,不具备对猪瘟病毒的抵抗能力,规模猪场应该对这些母猪进行淘汰,减少猪瘟病毒在猪场传播的可能性。

三种试剂盒检测猪O型口蹄疫抗体的比较

应用两种ELISA试剂盒和一种正向间接血凝试剂盒对125份免疫猪血清进行了口蹄疫抗体水平测定,并对三种试剂盒测定结果的符合程度、及其各自的重复性进行了分析。试验结果表明三种试剂盒测得的抗体水平之间有较好的一致性,但两种ELISA试剂盒检测结果之间的一致性要略高于正向间接血凝与两种ELISA试剂盒之间的一致性;三种试剂盒各自的检测结果重复性良好。

新型剪叉式应急桥梁的设计与分析

自然灾害发生后,道路桥梁的快速修复对于救援工作尤为重要,而传统道路桥梁修复方法往往需要消耗较长的时间。该文基于可展结构的理念,提出了一种建造方便快捷的剪叉式应急桥梁,并对其设计原理进行了分析。结合桥梁建造和使用过程的实际情况,建立了两种典型状态下的平衡方程。针对轻型车辆以剪叉杆弯曲应力为控制应力设计了一座三剪式桥梁,并制作了一个全尺模型进行荷载试验,试验结果与理论分析结果较吻合,验证了设计方法的正确性和这种新型桥梁用于灾后应急救援的可行性。

振动切削截煤模拟试验台的研制

为了探究振动切削截煤的有效性，建立了振动截割模拟试验台，该试验台简单地模拟截齿的截煤过程，完成多种振动参数（振动波形，振动频率，振幅），截割参数（截距，截深和截割速度）以及振动方向，截割运动方向和层理三者之间的相对方向的改变，实现振动切削截煤模拟试验。

规模猪场生猪传染病的防控

生猪传染病的防控是养猪成败的关键,一个猪场只有将传染病控制好才能在养猪业立于不败之地。那么,在我国,养猪户多、散,且养殖水平较低,疾病纷繁复杂的形势下,规模猪场应该如何进行传染病的防控呢？笔者以为主要从＂种＂,＂养＂,＂防＂三方面同时开展工作方能达到疾病防控的目的。现简述如下：

哺乳仔猪猪瘟病毒感染的实验室诊断及其防控分析

2011年3月，湖南省益阳某存栏300头母猪的猪场有80％的哺乳仔猪m现体温偏高，眼角分泌物增多．托稀，部分仔猪黄疸，用抗乍素药物治疗无效．死亡牢达到90％以上。剖检病变主要表现为肾脏皮质出血，淋巴结边缘严重出血．极个别病程长的仔猪可见喉头出血，脾脏有梗死灶，膀胱出血，

保育猪肠套叠并发脑膜炎型链球菌病的诊断与分析

猪链球菌病是由C、D、E及L群链球菌引起的猪的多种疾病的总称。自然感染的部位是上呼吸道、消化道和伤口。表现为急性出血性败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎等。脑膜炎型多见于70~90日龄的小猪,病初体温40℃~42℃,不食,便秘,继而出现神经症状,如磨牙、转圈、前肢爬行、四肢游泳状或昏睡等,有的后期出现呼吸困难,如治疗不及时往往死亡率很高。本病流行无明显季节性,

黑山羊细颈囊尾蚴与弯曲杆菌混合感染的诊治

1发病情况 2014年9月湖南株洲某黑山羊养殖场羊只发病,发病主要表现为消瘦、病程长、慢性死亡,少数怀孕母羊消瘦后出现流产现象。用阿苯达唑多次驱虫仍没有明显效果。63只羊,35 d内死亡11只。