抗末端脱氧核苷酰转移酶单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步鉴定

本文用提纯的小牛胸腺末端脱氧核苷酰转移酶（ＴｄＴ）为免疫原，经一次融合，建立了３株能稳定分泌抗小牛胸腺ＴｄＴ单克隆抗体（单抗）的杂交瘤细胞株（命名为抗ＴｄＴ１、ＴｄＴ２和ＴｄＴ３）。３株单抗均为ＩｇＧ１抗体；抗体相加试验证明抗ＴｄＴ２和抗ＴｄＴ３识别ＴｄＴ的同一表位，而抗ＴｄＴ１则识别另一表位；３株单抗识别的抗原分子量均为５８．８ｋＤ；与人白血病细胞株及各型白血病细胞的反应谱３株单抗和进口抗ＴｄＴ单抗基本一致。提示这３株单抗有可能替代进口抗ＴｄＴ单抗，供国内使用。

直标鼠抗人CD14单克隆抗体2F9-FITC的研制及鉴定

目的研制异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的直标单克隆抗体2F9-FITC,用于白血病的免疫分型诊断。方法2F9杂交瘤细胞的亚克隆,2F9腹水的制备、纯化、纯度鉴定按照常规方法进行;参考改良Marsshall氏法,制备FITC标记的2F9-FITC单抗;通过流式细胞术鉴定单抗亚型,比较2F9-FITC和标准CD14-FITC在不同类型白血病细胞上的表达情况。结果制备了大量高纯度的IgG1κ亚型2F9单抗,成功研制了直标单抗2F9-FITC,A495/A280比值为0.44;2F9-FITC与CD14-FITC在单核细胞上反应的阳性细胞百分数分别为84.50%及90.08%,而在淋巴细胞仅为0.52%和1.01%;2F9-FITC与标准CD14-FITC在各类白血病细胞上的阳性细胞百分数的差异不显著(n=23,t=0.922,P=0.367)。结论研制的2F9-FITC能够替代进口的同类高质量单抗试剂,用于单核细胞相关性白血病的免疫诊断。

白细胞新单克隆抗体ZCH-2B8a的表达谱分析及其意义

ZCH-2B8a(IgG2a)是作者研究室最近采用髓细胞性白血病细胞系KG1a作为免疫原自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆抗体,已提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(HLDA8)鉴定。根据HL-DA8总部反馈信息表明,该抗体识别的抗原性质不明,后者属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原。本研究旨在分析ZCH-2B8a单克隆抗体与正常人外周血细胞成分、骨髓及G-CSF动员的外周血CD34+造血干/祖细胞和血液肿瘤细胞系的反应规律及其意义。采用多参数流式细胞术分析2B8a抗体与正常及恶性肿瘤细胞表面的反应性,每种细胞成分重复实验3次,以阳性细胞数≥20%为阳性。结果表明:2B8a抗原在外周血B细胞上表达(3/3例,平均阳性细胞数为26.29%),而在T淋巴细胞和NK细胞上不表达(0/3例);在粒细胞和单核细胞上阳性表达均为2/3例,平均阳性细胞数分别是23.72%和59.84%;在DC细胞、红细胞和血小板上均不表达(0/3例)。2B8a抗原在骨髓CD34+细胞上的阳性表达是3/3例,平均阳性细胞数39.33%,而在G-CSF动员的外周血CD34+细胞上的阳性表达仅1/3例,平均阳性细胞数为1.25%。2B8a抗原在B系细胞系Raji、SMS-SB、Nalm-6和Nall-1上的平均阳性细胞数分别为98.78%、98.61%、94.93%和5.68%;在T系细胞系Molt-3上的平均阳性细胞数为31.40%,而在Molt-4、JM和CCRF-CEM细胞上不表达;在髓系细胞系U937、Meg-01、HL-60、K562、KG1a和HEL92.1.7上的平均阳性细胞数分别为67.78%、33.40%、29.70%、28.19%、16.23%和8.02%;在神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、KCNR、BE、LAN-1和SK-N-AS细胞以及结肠癌细胞系HR8348细胞上均不表达,而在羊膜细胞系FL细胞上呈一定的阳性表达,平均阳性细胞数为45.03%。结论:在正常外周血,2B8a抗体主要与B淋巴细胞和单核巨噬细胞反应,在骨髓和外周血CD34+造血干/祖细胞中也有不同程度的反应性;在细胞系上,2B8a抗体主要与B系细胞系、单核巨噬细胞系及上皮性肿瘤细胞系反应,提示该抗体有可能用于上述肿瘤的免疫学诊断与治疗。

K562/VCR单克隆多药耐药亚细胞系的建立

目的 建立耐药性较为均一的 K5 6 2 / VCR多药耐药 (MDR)亚细胞系 ,为更好研究多药耐药性的产生以及逆转机制提供良好的实验材料。方法 采用三种不同的培养方法和有限稀释法对 K5 6 2 / VCR MDR细胞系进行亚克隆培养 ,并用流式细胞仪 (FCM)测定 p170的表达情况。结果 加用培养上清或滋养细胞存在的条件下 ,亚克隆效率明显高于无条件培养液 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1)。建立的单克隆 MDR亚细胞系 6株 ,FCM分析证实 p170呈不同程度的表达 ,其中表达最高者为 31.4 % (K5 6 2 / VCR A5 - A1)。结论 (1)耐药细胞系的亚克隆培养需要条件培养液或滋养细胞的支持 ,后者较前者更为有效。 (2 )成功建立了 6株 K5 6 2 /

四氢叶酸钙对解救ALL患儿首疗程大剂量甲氨喋呤毒性的探讨

目的 :比较儿童急性淋巴细胞白血病大剂量甲氨喋呤 -四氢叶酸钙 ( HD- MTX- CF)疗法的2种方案的毒副反应。方法 :第 1组 ( 2 4例 )四氢叶酸钙 ( CF)总量为 MTX的 6.8% ,解救时间为静滴 MTX 2 5h后开始 ;第 2组 ( 30例 ) CF剂量为 MTX的 3.4 % ,解救时间为静滴 MTX 36h后开始。结果 :2组化疗后皮肤损害、GPT升高、血小板下降以及感染发生率 ,第 2组较第 1组显著 ( P<0 .0 1)。结论 :方案 2的毒副反应发生率与方案 1相比有明显增加 ,盲目延长 CF的解救时间和减少CF的用量对患儿是危险的。

大肠癌细胞系HR8348白细胞分化抗原的表达

目的 :了解大肠癌细胞的免疫表型特征。方法 :采用三色直接免疫荧光标记法 ,使用流式细胞仪检测了4 0种抗白细胞分化抗原单克隆抗体 (Mo Abs)与大肠癌细胞系 HR8348的反应性。结果 :抗 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、TCR (α/β)、TCR (δ/γ)、CD10、 CD11b、 CD14、CD16、CD19、CD2 2、CD2 5、CD2 8、CD33、 CD34、CD35、CD36、CD38、CD4 1a、CD4 5、CD4 5 RA、CD4 5 RO、CD5 6、CD6 1、CD6 4、CD6 6 b、CD6 9、CD71、CD117、CD12 2和 LambdaF (ab') 2 Mo Abs与 HR8348细胞系均不反应 (阳性率 (10 % )。抗 CD13、CD15、CD2 0、CD38、CD95和 HLA- DRMo Abs与细胞系 HR8348呈不同程度的阳性反应 (阳性率 11.33%～ 86 .39% )。结论 :实验证明 ,大肠癌细胞系HR8348与白细胞谱系有部分相同的细胞表面抗原决定簇。

多参数流式细胞术观察251例白血病细胞CD14表达的意义

目的 探讨 CD14在白血病细胞的表达及其在白血病诊断和鉴别诊断中的意义。方法 采用 CD45 /SSC参数设门多色流式细胞术分析 2 5 1例白血病细胞 CD14及其它白血病相关抗原的表达情况。结果 2 5 1例中有 19例 ( 7.5 % )白血病细胞表达 CD14,95例急性髓系白血病 ( AML )中 16例 ( 16 .8% )白血病细胞表达 CD14,130例淋系白血病未见 CD14阳性的病例。 M4和 M5b CD14的阳性率 ( 9/ 14;6 / 6 )明显高于 M2 ( 1/ 30 ) ( P=0 .0 0 1;P=3.6× 10 - 6 )及 M5a( 0 / 5 ) ( P=0 .0 3;P=2 .2× 10 - 3 )。标准 CD14单抗均不与 5例 M5a细胞反应 ,而自制 CD14新克隆 2 F9单抗则全部阳性。5例 M5a中 1例 CD15和 2 9例 M2 中 13例 CD11b的阳性率明显低于 M5b( 6 / 6 ,P=0 .0 2 ;6 / 6 ,P=0 .0 2 )。在 AML 组中 ,CD14的表达与 CD117呈负相关 ( r=- 0 .2 ,n=81,P=0 .0 3) ,与 CD11b、CD15及HL A- DR呈正相关 ( r=0 .5 ,n=93,P=0 .0 0 1;r=0 .4,n=95 ,P=0 .0 0 1;r=0 .2 ,n=95 ,P=0 .0 2 )。结论 CD14有助于淋巴系白血病、髓系白血病及其单核细胞相关性白血病的诊断与鉴别 ,其对单核细胞相关性白血病免疫分型诊断中的特异性为 96 .7% ,敏感性为 6 0 .0 %。

CD117/CD11b在急性早幼粒细胞白血病不同病期的表达变化

为了了解CD117/CD11b在急性早幼粒白血病细胞初诊及治疗后的表达变化,探讨其表达变化对APL诊断和预后的意义,采用CD45/SSC双参数散点图设门方法进行三色或四色流式细胞术细胞表面及浆内分化抗原分析,应用RT-PCR技术检测骨髓中PML/RARα融合基因的mRNA表达。结果表明APL与CML慢性期都高表达MPO、CD13和CD33,而几乎不表达CD34、HLA-DR及T,B淋巴系列标志。有14.5%的APL患者表达CD56,有48.2%的APL患者表达CD15,CD15在APL的表达明显低于CML慢性期(48.2%vs95.2%,P<0.01)。有78.3%的APL患者表达CD117,而在CML慢性期不表达CD117。CD11b在APL的表达率仅为16.9%,而在CML慢性期几乎都表达CD11b。有72.3%的APL患者呈CD117+CD11b-表型,而在CML慢性期患者细胞中均未见此表型,它几乎均呈CD117-CD11b+表型。11例表型为CD117+CD11b-的APL患者经治疗获完全缓解,在2个月以后CD117阳性细胞百分率均小于5%,同时细胞高表达CD11b,呈CD117-CD11b+表型。检测31例APL患者PML/RARα融合基因,25例该融合基因阳性,阳性率为80.6%,其中16例(64%)为PML/RARα基因L型,9例(36%)为S型。16例PML/RARα融合基因L型APL患者CD117表达有14例(87.5%),9例S型CD117表达有4例(44.4%),6例PML/RARα融合基因阴性APL患者CD117表达有2例(33.3%)。结论CD117/CD11b表型分析有助于APL与其它AML亚型及CML慢性期细胞的鉴别,CD117+CD11b-表型有助于APL细胞和APL患者缓解恢复期的良性髓系增生细胞的区分,对APL患者的治疗方案选择、预后判断以及发病机理的研究等均有重要价值。

小儿噬血细胞性淋巴组织细胞增生症41例诊断及预后分析

目的探讨小儿噬血细胞性淋巴组织细胞增生症的诊断及预后情况。方法回顾性分析41例小儿噬血细胞性淋巴组织细胞增生症患儿的临床资料。结果41例中男20例,女21例;中位年龄2岁(23d～13岁),均符合诊断标准。2例继发严重心脏并发症。应用流式细胞仪检测血细胞因子9例,结果白介素2、4、6和肿瘤坏死因子正常或轻度增高,白介素10和γ干扰素均增高或显著增高,显著增高与预后不良有关。随访时间3个月～5年,至今好转或治愈23例(占56.1%),死亡11例(占26.8%),失访7例(占17.0%)。结论小儿噬血细胞性淋巴组织细胞增生症发病年龄多数较小,病死率高,可见严重心脏并发症;白介素10和γ干扰素显著增高可能与预后不良有关。

多参数流式细胞术检测急性白血病患儿CD14表达的意义

为了探讨CD14在小儿白血病中的表达及其在白血病诊断和鉴别诊断中的意义 ,本文采用CD45/SSC多参数散点图设门多色流式细胞术分析158例小儿急性白血病 (AL)患儿白血病细胞的CD14及其它白血病相关抗原的表达情况。结果 :158例中有9例 (5.7 %)表达CD14,且均为急性髓系白血病 (AML)。CD14在M4/M5患儿中的阳性率明显高于非M4/M5患儿 (P<0.01) ;M4和M5b患儿CD14的阳性率明显高于M2及M5a(P均<0.01);CD11b在M2的阳性率 (6/20例,30 %)明显低于M5(7/9例,77.8 % ,P<0.05) ;CD15在M5a的阳性率明显低于M5b (P<0.05)、M2 (P<0.01)及M4 (P<0.05)。在AML组中 ,CD14的表达与CD11b、CD15呈正相关 (P均<0.01)。提示CD14有助于淋巴系白血病、髓系白血病及单核细胞相关性白血病 (MLIL)的诊断与鉴别诊断 ,其对单核细胞相关性白血病免疫分型诊断中的特异性为100% ,敏感性为64.3 %。CD14和CD15有助于M5亚型的区分及M2与M5a、M2与M4的鉴别诊断 。

CD56在急性白血病细胞中的表达及临床意义

为了探讨CD5 6在急性白血病细胞中的表达情况及意义 ,采用多色流式细胞术 (FCM )对 70例急性白血病患者细胞表面CD5 6及其它白细胞分化抗原表达进行了分析。结果表明 ,70例中有 16例 ( 2 2 .86 % )表达CD5 6 ,急性髓性白血病 (AML)的CD5 6阳性表达率 ( 15 / 31,4 8.39% )明显高于急性淋巴细胞白血病 (ALL) ( 1/ 35 ,2 .86 % )(P <0 .0 1)。CD5 6在AML各亚型中表达也有差异 ,AML M0 , M1和 M2 中阳性率 ( 11/ 15 )明显高于AML M3 , M4和 M5( 4 / 16 ) (P =0 .0 13)。 15例CD5 6 +的AML病例中表达HLA DR 13例 ( 4 1.94 % ) ,两者呈明显正相关(r =0 .4 39,n =31,P =0 .0 14 )。结论 :CD5 6主要在AML中表达 ,对AML的诊断。

ABCG2在白血病细胞中的表达及其意义

目的探讨三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)在白血病细胞膜上的表达规律及其意义。方法应用CD45/SSC参数设门多色流式细胞术分析61例白血病患者白血病细胞膜ABCG2及其他白血病细胞相关抗原的表达情况。结果61例急慢性白血病患者的白血病细胞ABCG2表达阳性率为36.07%。ABCG2表达阳性率,急性白血病(AL)患者眼34.48%(20/58)演与慢性白血病(CL)患者眼66.67%(2/3)演鸦儿童患者眼26.09%(6/23)演与成人患者眼42.11%(16/38)演差别均无显著性意义(均P>0.05);急性髓细胞性白血病(AML)患者眼46.67%(14/30)演高于急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者眼16.67%(4/24)(P<0.05)演;AML患儿眼55.56%(5/9)演也高于ALL患儿眼7.14%(1/14)(P<0.05)演。ABCG2与另一耐药蛋白P糖蛋白(P-gp)及其他细胞表面抗原的表达均无关(r=0.152、-0.075、-0.063、0.026、-0.149,均P>0.05),与髓系标志CD13的表达有关(r=0.307熏P<0.05)。结论ABCG2在AML患儿中的表达较高,其高表达可能导致AML患儿临床耐药。ABCG2和P-gp可能参与了不同的白血病耐药机制。

实时荧光定量RT-PCR检测白血病细胞WT1 mRNA方法的建立

目的 建立实时荧光定量 RT-PCR检测白血病细胞 WT1m RNA的方法。方法 在 PCR反应体系中加入了一条与靶基因序列互补的寡核苷酸双荧光标记探针 (5′端为荧光报告基团 ,3′端为荧光淬灭基团 ) ,建立实时荧光定量 RT-PCR检测白血病细胞 WT1m RNA的方法 ,并测试其特异性及敏感性。结果 所建立的实时荧光定量 RT-PCR检测 WT1m RNA的方法具有很好的准确性 ,检测 WT1m RNA的灵敏度达 10 - 4。方法的变异系数为1.93 % ,稳定性较好。循环阈值与 PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系 (斜率为 -3 .5,线性相关系数 r=0 .997) ,可对 WT1m RNA的表达进行准确定量分析。结论 实时荧光定量 RT-PCR检测白血病细胞WT1m RNA的方法具有很好的特异性和敏感性 ,且操作简便、安全。

儿童急性早幼粒细胞白血病46例长期随访及预后分析

目的探讨儿童急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗、长期生存和预后因子。方法对该院1998年4月至2005年10月收治的APL患儿46例进行临床分析。诱导缓解采用全反式维甲酸(ATRA)+柔红霉素(DNR)或吡柔吡星(THP),巩固治疗采用大剂量阿糖胞苷与DA(柔红霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)、EA(足叶乙甙+阿糖胞苷)方案交替给药,维持阶段ATRA与DA,HA,EA方案交替治疗,总疗程为2.5年。结果39例患儿进行了正规治疗,36例(92.3%)获完全缓解(CR)。39例患儿1年、3年和5年总体生存率(OS)分别为(86.1±5.8)%,(76.1±7.5)%和(70.2±8.9)%,1年、3年、5年的无事件生存率(EFS)分别是(78.4±6.8)%,(63.6±8.7)%和(53.1±10.0)%。5年累积复发率(CIR)28.6%。其中WBC≤10.0×109/L者的5年OS[(81.4±10.3)%]明显高于WBC>10.0×109/L者[(51.6±14.7)%,P<0.05]。获CR的PML/RARα融合基因短型(S型)的患儿5例最后全部死亡,而长型(L型)患儿13例无死亡发生,两者差异有统计学意义(P<0.01)。结论ATRA+DNR或THP诱导缓解治疗儿童APL安全、有效,可以作为初发儿童APL的标准诱导治疗方案。联合蒽环类及阿糖胞苷等药物化疗能明显改善长期生存率。高WBC和S型PML/RARα融合基因阳性的患儿预后不佳。

急性白血病细胞中CD19的表达

目的 观察 CD19在急性白血病 (AL )中的表达与分布 ,为白血病的诊断、鉴别以及导向治疗提供依据。方法 采用 2 7个荧光直标单克隆抗体 (单抗 )及 CD45/ SSC双参数设门多色流式细胞术对 3 2 1例 AL细胞进行免疫诊断和分型 ,并对 CD19在各类型 AL细胞中的表达情况进行分析。结果 在 116例 B细胞系急性淋巴细胞性白血病 (AL L)患者中 ,CD19的阳性率 (99.1% )明显高于 B细胞系其它相关性抗原的阳性率 ;CD19在 17例含 B细胞系成分的杂合型白血病 (HAL )中全部表达 ,而在 2 9例 T细胞系 AL L和 7例 T/ My HAL则均无表达 ;在 152例急性髓系白血病 (AML)中 ,仅 11例 (7.2 % ) CD19阳性 ,明显低于其在 B细胞系 AL L 中的阳性率 (P=0 .0 0 1) ;CD2 2在 B/ My HAL的阳性率 (12 / 15,80 .0 % )明显高于 CD19+ -AML (0 / 11,0 % ,P<0 .0 0 1)。结论 CD19对 B系AL L 细胞的特异性较好 ,敏感性较高 ,是诊断 B细胞系 AL L 较为可靠的表面标记 ,也可作为导向治疗 B细胞系AL