GATA3通过调控LIFR抑制人乳腺癌细胞的迁移能力

目的探究GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对乳腺癌细胞迁移能力的影响。方法在MCF7细胞中利用慢病毒载体介导的基因干涉技术敲低GATA3基因,使用实时定量荧光PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测GATA3和LIFR的mRNA和蛋白表达水平,Transwell实验检测MCF7细胞的迁移能力。在MCF7和T47D细胞中用染色质免疫沉淀(ChIP-qPCR)实验检测GATA3在LIFR的启动子区的结合位点。在敲低GATA3基因的MCF7细胞中回补LIFR,通过细胞划痕实验和Transwell实验检测MCF7细胞的迁移能力。结果与对照组相比,敲低GATA3基因的MCF7细胞的迁移能力增强(P_(均)<0.05)。与对照组相比,敲低GATA3基因的MCF7细胞的LIFR表达水平降低(P_(均)<0.05)。乳腺癌细胞MCF7与T47D中GATA3在LIFR的启动子区有结合(P_(均)<0.05)。在敲低GATA3基因的MCF7细胞中稳定过表达LIFR可以部分挽救GATA3基因敲低引起的细胞迁移能力的增强(P_(均)<0.05)。结论GATA3通过转录激活LIFR抑制乳腺癌细胞MCF7的迁移。

靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果 酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2+肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明,提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论 通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2+肿瘤细胞。

靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞毒性作用的体内外验证

目的 对靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞进行毒理学评估,为其后期HER2-CAR-T细胞治疗的临床上评估提供安全性依据。方法 利用重组慢病毒载体制备HER2-CAR-T细胞,采用软琼脂集落形成实验,观察HER2-CAR-T细胞集落形成情况并对集落形成率进行统计分析;将HER2-CAR-T细胞悬液与兔红细胞悬液共孵,通过直接观察法以及酶标仪检测法评估红细胞溶解情况;对雄性新西兰兔耳缘静脉注射HER2-CAR-T细胞制剂,通过组织切片染色观察HER2-CAR-T细胞对动物血管的刺激作用;以pMD 2.G载体上的水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白(VSV-G)基因为目标序列,利用荧光定量PCR进行慢病毒载体安全性的验证;取接受HER2-CAR-T细胞输注的小鼠心、肝、肺、肾,HE染色观察其病变情况。结果 成功制备了HER2-CAR-T细胞,这些细胞在体外不具备软琼脂集落形成能力,HER2-CAR-T细胞制剂对新西兰兔红细胞不产生溶血现象。新西兰兔耳缘静脉输注HER2-CAR-T细胞后未发现明显血管刺激反应,也未检测到VSV-G的特异性扩增,治疗组小鼠心、肝、肺、肾组织未见明显病变。结论 所制备的HER2-CAR-T细胞具有可靠安全性。

细胞周期相关肿瘤高表达蛋白(CREPT)在前列腺癌高表达并促进前列腺癌进展

目的研究细胞周期相关肿瘤高表达蛋白(CREPT)在前列腺癌中的表达情况和对前列腺癌发生发展的影响。方法采用基因表达谱交互分析数据库2(GEPIA2)和癌基因组图谱(TCGA)数据库进行生物信息学分析,22Rv1前列腺癌细胞转染CREPT小干扰片段下调CREPT表达,采用CCK-8法、Transwell^(TM)实验和划痕愈合实验检测细胞的增殖、侵袭和迁移。体内裸鼠荷瘤实验检测CREPT对前列腺癌发生发展的影响。结果CREPT在前列腺癌中异常高表达,并与无进展生存期、肿瘤T分期、N分期、前列腺特异性抗原(PSA)水平和Gleason评分相关。CREPT能够促进前列腺癌22Rv1细胞增殖、侵袭和迁移。体内裸鼠荷瘤实验表明CREPT能够促进前列腺癌的进展。免疫浸润分析结果表明CREPT高表达与CD8+T细胞的浸润呈负相关。结论CREPT是潜在前列腺癌预后标志物,有望成为前列腺癌新的治疗靶点。

抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定

OK T8杂交瘤细胞株从American typecuhure collection(ATCC)获得,产生抗人CD8分子的单克隆抗体IgG2a(γ2a,κ),为了对这一鼠源性单抗进行基因工程改造,我们首先克隆了该单抗的κ轻链可变区基因,并测定了其碱基序列,现将结果报道如下: 通过计算机查找并分析了已发表的几十株抗体的轻链可变区基因序列,经比较其5’端保守序列和J区序列,设计了一对DNA引物:GTGAATTCATGGACATCCAGATGACCCA-

抗人CD3单抗重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５’端序列和Ｊ区序列，化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，反转录生成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板，分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ，扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ，编码１１９个氨基酸，轻链可变区基因全长３２１ｂｐ，编码１０７个氨基酸。

主动PBL方法在八年制《医学免疫学》教学中的应用与思考

八年制医学生的培养目标是培养临床医学博士。医学免疫学是与临床联系较为紧密的基础课之一,在教学中如何加强学生处理临床问题的逻辑思维能力和提高探讨临床表象之下深层次科学问题的科研思维水平,一直是免疫学教学的主要关注之一。PBL（Problem based learning,PBL）教学方法由美国的神经病学教授Barrows于1969年首创,是以问题为导向的教学方法,是以学生为中心的教育方式,

采用互动式教学进行《医学免疫学》课堂授课的体会

医学免疫学是基础医学的重要组成部分,是我国高等医学院校的专业必修课。作为生命科学的前沿学科,医学免疫学的理论和技术发展日新月异,并不断向临床医学和预防医学等多学科渗透,已逐步成为沟通基础医学和临床医学的重要桥梁学科。尽管具有重要的学科地位,但医学免疫学具有理论性强,内容抽象、枯燥等特点,大部分学生认为它是一门让人头疼的学科,大量的免疫学概念,免疫分子、免疫细胞之间的相互作用,以及它们与临床疾病之间的关系，使学生们感到非常难以理解和记忆。

PD-1/PD-L1参与肿瘤免疫逃逸的研究进展

程序性死亡分子1及其配体(PD-1/PD-L1)是一对负性免疫共刺激分子,正常情况下,组织细胞表面的PD-L1与淋巴细胞表面的PD-1结合后,可抑制淋巴细胞功能,诱导活化的淋巴细胞凋亡,从而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中发挥重要作用。多种肿瘤细胞表面也表达PD-L1,肿瘤细胞表达的PD-L1,可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合,抑制淋巴细胞的功能及细胞因子的释放,并诱导淋巴细胞凋亡,从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用,最终导致肿瘤发生免疫逃逸。

重组人凋亡诱导因子基因的构建、表达及其对HeLa细胞的促凋亡作用

凋亡诱导因子 (apoptosis inducingfactor ,AIF)定位于细胞的线粒体膜间隙 .当凋亡信号刺激时 ,AIF分子从线粒体释放到胞浆 ,然后转位到细胞核内 ,引起染色体核周边凝集和DNA呈大片段断裂 (～ 5 0kb) .用RT PCR法分段克隆得到人全长AIF基因 ,经改造截去其N端线粒体定位信号编码序列 ,代之以不同长度的绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域序列 .把这些重组基因克隆入 pIRES2 EGFP真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过荧光显微镜观察、共聚焦显微镜观察、电镜观察等方法检测了多种重组人AIF基因的表达及其对细胞生长的影响 .证明了重组人AIF基因的表达可引起HeLa细胞死亡 。

抗人CD_3单链抗体基因的构建及序列分析

本文在已克隆抗人ＣＤ３抗体ＶＨ和Ｖｋ基因的基础上，设计并合成了ＰＣＲ引物。两个外侧引物分别含有ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ酶切位点及起始码和终止码序列，４个内侧引物各含部分连接肽基因序列。用加端ＰＣＲ分别在ＶＨ基因３＇端和Ｖｋ基因５＇端延伸部分连接肽基因序列，回收后混合运火；应用重叠延伸拼接法，将ＶＨ和Ｖｋ基因通过Ｌｉｎｋｅｒ序列串联为单链抗体基因；利用ＰＣＲ产物两端预先设计的ＳａｌＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点，将其克隆到ｐＵＣ１９质粒中，筛选到阳性克隆。经双脱氧终止法序列测定：ＶＨ和ＶＫ基因及Ｌｉｎｋｅｒ序列均正确，为用基因工程技术生产单链抗体奠定了基础。

NT3基因工程细胞经脑脊液途径的耳蜗内生物学效应的初步证明

目的 通过脑脊液途径移植神经营养因子 - 3(NT3)基因工程细胞 ,初步观察其耳蜗内听觉生物学效应。方法 将体外构建的NT3基因工程细胞扩大培养 ,收集浓缩培养上清中的蛋白 ,用印迹杂交鉴定其分泌蛋白的生物学效应 ,再将适当的细胞直接移植到 2 0天龄近交BALB/C小鼠的脑脊液中 ,4 0天后比较移植前后的畸变产物耳声发射 (DPOAE)幅值。结果 体外构建NT3基因工程细胞是可行的 ,其具备分泌NT3的功能 ,经脑脊液途径注射后观察到BALB/C小鼠耳蜗功能的老化在高频范围内得到了延缓 ,DPOAE高频范围幅值下降减缓。结论 NT3基因工程细胞具有较好的体外体内生物学效应 ,可以用于进一步实验治疗感音性聋的研究 ;

白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制

目的:探讨白藜芦醇(RES)诱导人肝癌HepG2、人慢粒K562肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制.方法:应用形态学方法,Annexin V荧光染色检测HepG2,K562细胞凋亡的发生,应用流式细胞术(FCM)检测细胞周期,应用四唑蓝比色法(MTT)检测HepG2,K562肿瘤细胞对,RES的药物敏感性.结果:RES对人肝癌HepG2细胞的生长有明显的抑制作用,并诱导肿瘤细胞发生凋亡.凋亡细胞表现为细胞固缩,核染色质碎裂.Annexin V荧光染色检测HepG2细胞凋亡率为33.7%,用FCM检测细胞周期明显阻止于G1期,而K562细胞凋亡率为9.97%.MTT检测表明RES对人肝癌HepG2细胞有剂量-效应关系.但RES对人K562细胞的生长无明显的抑制作用.结论:RES通过诱导HepG2细胞凋亡抑制肿瘤的生长,并有剂量-效应关系.同时RES对肿瘤细胞的抑制及诱导凋亡的作用有细胞选择性.

Caspase-3融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 观察重构型 caspase- 3及其 N-端融合蛋白的表达对 He L a细胞的凋亡诱导作用 .方法 用反转录 PCR获取人 caspase- 3基因 ,用重组 PCR方法构建人重构型 caspase-3及其融合蛋白基因 ,将基因克隆入表达载体 pc DNA3,脂质体法转染 He L a细胞 ,通过细胞计数、电镜观察、MTT法等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况 .结果 成功获得了 cas-pase- 3基因 ,构建了重构型 caspase- 3基因和重构型 caspase- 3与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因及其表达载体 ,与对照组相比 ,在转染后 1～ 4d内 ,两种基因的表达均导致 He L a细胞存活数减少 ,大量细胞发生凋亡 ,且二者活性相当 .结论 重构型 caspase- 3及其融合蛋白可以诱导转染的 He L

《免疫与感染基础》模块教学的总结和思考

作为生命科学领域的前沿学科和一门重要的交叉学科,医学免疫学在所有医学类院校的基础医学课程体系中占据着重要位置,在基础医学与临床医学教学间起着桥梁作用。近年来科学技术的飞速发展,带动了医学免疫学学科本身的迅猛发展,加之我国目前的医学教育模式正在积极推进改革,医学免疫学作为基础医学教育中的支柱学科,如何使之顺应医学教学改革的新方向,如何使医学生摆脱免疫学单一学科的晦涩难懂及学科本身抽象枯燥的难题，使学生在掌握医学免疫学理论的基础上，全面系统了解疾病发生发展过程中的免疫调控规律，同时提高授课内容的丰富性及趣味性，是目前免疫学教学改革的重点。

干涉lncRNAs HOTAIR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响

目的:探讨利用RNA干涉沉默HOTAIR基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响。方法:利用脂质体转染MDA-MB-231细胞;qPCR检测HOTAIR基因的表达;检测EMT相关的Snail蛋白水平的表达;流式细胞术检测凋亡率;MTT法检测细胞增殖。结果:干涉HOTAIR基因后细胞中Snail蛋白表达水平下降,细胞凋亡增加。结论:靶向HO-TAIR的序列特异性siRNA可显著抑制HOTAIR基因的表达;干涉HOTAIR基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

凋亡诱导因子是线粒体内介导核凋亡的最主要蛋白质之一

凋亡诱导因子 (apoptosis inducingfactor ,AIF)基因定位于X染色体上 ,其编码产物是一种可直接介导细胞核凋亡的效应分子 .鼠AIF前体蛋白在胞浆中合成后 ,通过其N端的线粒体定位信号 (MLS)有效地穿入线粒体膜间隙 ,然后在 10 2位甘氨酸处水解掉MLS ,其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)结合 ,并重新折叠成为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子 ,分子质量为 5 7ku .当凋亡信号刺激时 ,AIF分子从线粒体释放到胞浆 ,然后转位到细胞核内 ,引起染色体核周边凝集和DNA呈大片段断裂 (～ 5 0kb) .该作用不受广谱caspases抑制剂z VAD .fmk的抑制 ,也不受Bcl 2过量表达的影响 .基因剔除实验表明 ,AIF蛋白的促凋亡活性是胚胎小鼠形态发生过程中类胚体成腔所必需的 ,而且是AIF独立作用的结果 ,可以不依赖caspase 3的活性 .因此AIF介导的细胞凋亡可能代表了独立于caspase通路之外的另一条更原始、更保守的凋亡途径 .

siRNA干扰ClC-2表达对人胶质瘤U-87细胞增殖的抑制作用

背景与目的:利用小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制哺乳动物基因表达已成为研究基因功能的一种有效方法。本研究采用siRNA抑制人神经胶质瘤细胞系U-87细胞上容积调控氯通道ClC-2基因的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响。方法:设计和构建两个针对人ClC-2基因的siRNA真核表达载体,并给予酶切鉴定和DNA序列分析鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒pSUPER.puro-shRNA和两个重组质粒pSUPER.puro-shRNA-ClC-21、pSUPER.puro-shRNA-ClC-22分别转染入U-87细胞(依次为PP0组、PP1组和PP2组);采用RT-PCR检测ClC-2mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果:目的片段成功地连接到真核细胞表达载体pSUPER.puro上。PP1组、PP2组与对照组、PP0组相比较,ClC-2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期:细胞的G1期百分含量分别增加了约30.24%、18.04%(P<0.05)。平板克隆形成试验发现,克隆形成率PP1组[(11.0±1.0)%]、PP2组[(20±3.1)%]明显低于对照组[(46.5±1.6)%]和PP0组[(47.5±2.8)%](P<0.01)。结论:干扰人神经胶质瘤细胞系U-87细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的增殖,提示ClC-2基因可能成为控制人恶性胶质瘤生长的新靶点。