特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响

目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期。结果菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确。并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因。细胞周期检测提示PTH1R沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期。结论成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。

甲状腺肿瘤原位细胞凋亡检测与PPARγ表达的研究

目的:研究原位细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)及核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)在原发性甲状腺肿瘤中的表达及其与病变的关系。方法:对87例原发性甲状腺肿瘤组织(乳头状腺癌38例,滤泡性腺癌21例,未分化癌5例,腺瘤23例)分别应用原位细胞凋亡检测(TuNEL)试剂盒测定AI及应用免疫组化方法检测PPARγ表达情况。结果:AI及PPARγ蛋白在各甲状腺肿瘤组织均有表达,AI在腺癌表达高于腺瘤(P<0.01),PPARγ在滤泡性腺癌及腺瘤表达显著高于乳头状腺癌及未分化癌(P<0.01);AI及PPARγ有正相关性(r=0.554,P<0.01)。结论:AI及PPARγ的表达与甲状腺肿瘤显著相关,检测AI及PPARγ水平对于鉴别原发性甲状腺滤泡癌具有重要参考意义。

甲状旁腺素相关肽对INS-1细胞株增殖的影响

目的:探讨甲状旁腺素相关肽(PTHrP)对大鼠胰岛β细胞瘤株INS-1胰岛素分泌的促进作用。方法:分别应用不同浓度PTHrP干预INS-1细胞,应用MTT法检测细胞生长活力,然后应用Western blot检测细胞Ki67、PDX-1、Bax及Bcl-2的表达,BrdU免疫荧光检测细胞增殖情况。结果:PTHrP具有浓度依赖性的促进INS-1细胞增殖,PTHrP显著上调Ki67、PDX-1及Bcl-2表达,下调Bax表达,PTHrP干预后细胞BrdU表达增高。结论:PTHrP可以促进胰岛β细胞增殖。

甲状腺肿瘤中增殖细胞核抗原和垂体肿瘤转化基因-1的表达

目的研究增殖细胞核抗原(PCNA)及垂体肿瘤转化基因-1(PTTG-1)在甲状腺肿瘤中的表达及其与病变的关系。方法对87例甲状腺肿瘤(乳头状腺癌38例,滤泡性腺癌21例,未分化癌5例,腺瘤23例)分别应用免疫组织化学方法检测PCNA及PTTG-1表达情况,并对各组瘤组织进行PCNA及PTTG-1表达比较,观察PCNA与PTTG-1的相关性。结果PCNA及PTTG-1蛋白在各甲状腺肿瘤组织均存在表达,PCNA在乳头状癌、滤泡性癌及未分化癌组中表达高于腺瘤组(P<0.05,P<0.01),PTTG-1在乳头状癌、滤泡性癌组表达高于腺瘤组(P<0.01);PCNA及PTTG-1在甲状腺肿瘤表达具有正相关性(r=0.36,P<0.05)。结论PCNA及PTTG-1的表达与甲状腺肿瘤相关,PCNA及PTTG-1水平升高可能参与甲状腺恶性肿瘤病程。

不同浓度葡萄糖对INS-1细胞PTHrP及PTH1R表达的影响

目的探讨不同浓度葡萄糖对INS-1细胞PTHrP/PTH1R表达的影响以及对细胞增殖的作用。方法将大鼠胰岛细胞瘤细胞株根据不同干预条件分为空白对照组,正常葡萄糖组(5mmol/L)组及高浓度葡萄糖(30mmol/L)组,培养96h应用MTT检测各组细胞活力,应用Western blot及RT-PCR检测PTHrP/PTH1R蛋白及mRNA表达。结果空白对照组及高浓度葡萄糖组细胞活力比正常葡萄糖组下降,高浓度葡萄糖组细胞活力低于无糖组,PTHrP和PTH1R蛋白或mRNA在高浓度葡萄糖组中表达显著下调。结论不同浓度葡萄糖可以通过调控PTHrP/PTH1R的水平从而影响INS-1的增殖。

氯沙坦抑制高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的探讨氯沙坦对高糖及间歇性高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化的抑制作用。方法实验分为空白组(0mmol/L葡萄糖)、正常葡萄糖组(5mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25mmol/L葡萄糖)、间歇性高糖干预组(5mmol/L葡萄糖/25mmol/L葡萄糖交替)、氯沙坦干预组(10μmol/L氯沙坦)、氯沙坦高糖干预组(10μmol/L氯沙坦预处理后再高糖培养)、氯沙坦间歇性高糖干预组(10μmol/L氯沙坦预处理后再间歇性高糖培养),根据分组对NRK-52E细胞施加相应因素作用72h后,蛋白免疫印迹法检测转分化标志物转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在细胞中的表达,CM2H2DCFDA试剂盒检测细胞ROS含量。结果高糖干预及间歇性高糖干预组TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA和PTHrP表达上调,ROS含量明显上升,间歇性高糖作用更显著。应用氯沙坦干预后可以部分下调高糖或间歇性高糖诱导的TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP表达,降低细胞ROS含量。结论氯沙坦可抑制高糖及间歇性高糖诱导的NRK-52E细胞转分化作用。

原发性甲状腺滤泡癌远处转移中病理标记物的诊断价值

原发性甲状腺滤泡癌（thyroid follcular carcinoma，TFC）常见的远处转移，主要由于血行转移到其他器官，少见淋巴转移。TFC临床诊断远处转移多依赖于影像学，而发现时常常是晚期，耽误了相关诊治［1］。既往本课题组进行了系列性TFC的研究，发现了个别病理标记物具有相关远处转移提示作用［2］，因此，我们分析35例 TFC 组织中PTTG等7种病理标记物的表达情况，旨在探讨它们在TFC是否存在远处转移的作用及其意义，寻找在该病变中有诊断意义的客观指标。

表现为库欣综合征的肾上腺皮质癌或腺瘤的临床特点比较分析

目的:探讨表现为库欣综合征的肾上腺皮质癌与肾上腺皮质腺瘤的临床特点。方法:分析42例表现为库欣综合征的肾上腺皮质癌或腺瘤的临床特点以及相互间差别。结果:7例肾上腺皮质癌患者的中位病程为8个月,4例伴有多毛、痤疮的表现,肿瘤直径的中位数为15.2cm;35例肾上腺皮质腺瘤患者的中位病程为20个月,23例有高血压,32例有向心性肥胖,肿瘤直径的中位数为2.7cm。与肾上腺皮质腺瘤患者相比,肾上腺皮质癌患者血皮质醇、尿24h17羟类固醇较低,而尿24h17酮类固醇明显升高,影像学检查阳性率较高,有6例发于左侧肾上腺,而且瘤体较大,预后较差。结论:表现为库欣综合征的肾上腺皮质癌患者肿瘤体积较大,多毛、痤疮等雄激素分泌过多的体征较多见,尿24h17酮类固醇明显升高;而表现为库欣综合征的肾上腺皮质腺瘤患者向心性肥胖、高血压等症状较多见,尿24h17羟类固醇较高。临床医师掌握两者的临床特点有助于提高诊断率。

甲状腺肿瘤中垂体肿瘤转化基因-1与微血管密度表达关系

目的研究垂体肿瘤转化基因-1(pituitary tumor-transforming gene1,PTTG)与微血管生成在原发性甲状腺肿瘤中表达及与病变的关系。方法对于87例原发性甲状腺肿瘤(乳头状腺癌38例,滤泡性腺癌21例,未分化癌5例,腺瘤23例)分别应用免疫组化方法检测PTTG及CD34表达情况。结果PTTG及CD34在各甲状腺肿瘤及间质组织均存在表达,PTTG在腺癌组表达高于腺瘤(P<0.01),微血管密度(MVD)在腺癌组表达显著高于腺瘤组(P<0.01);PTTG及MVD有正相关性(r=0.43,P<0.01)。结论PTTG及MVD的表达与甲状腺肿瘤显著相关,检测PTTG及MVD水平对于鉴别原发性甲状腺癌具有重要参考意义。

bFGF、PTTG在原发性甲状腺肿瘤中的表达及意义

采用免疫组化SP法检测78例原发性甲状腺肿瘤(腺瘤38例,腺癌40例)标本中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及垂体肿瘤转化基因(PTTG)的表达。结果为bFGF在腺瘤及腺癌组表达有显著性差异(P<0.01),PTTG在腺癌表达显著高于腺瘤(P<0.01);bFGF、PTTG均表达与癌转移、预后指数相关(P均<0.05)。bFGF与PTTG表达存在相关性(r=0.45,P<0.01)。认为bFGF及PTTG在原发性甲状腺癌病变中高度表达,联合检测两者水平对于判断甲状腺癌良恶性及其预后具有指导意义。

甲状腺肿瘤原位细胞凋亡检测与FHIT表达研究

目的:研究原位细胞凋亡指数及脆性组氨酸三联体在原发性甲状腺肿瘤中表达及其与病变的关系。方法:对于87例原发性甲状腺肿瘤(乳头状腺癌38例,滤泡性腺癌21例,未分化癌5例,腺瘤23例)分别应用原位细胞凋亡检测试剂盒测定凋亡指数及应用免疫组化方法检测脆性组氨酸三联体表达情况。结果:凋亡指数及脆性组氨酸三联体在各甲状腺肿瘤组织均存在表达,凋亡指数在腺癌表达高于腺瘤(P<0.01),脆性组氨酸三联体在腺瘤表达显著高于腺癌组(P<0.05);凋亡指数及脆性组氨酸三联体灰度值有负相关性(r=-0.39,P<0.05)。结论:凋亡指数及脆性组氨酸三联体的表达与甲状腺肿瘤显著相关,检测凋亡指数及脆性组氨酸三联体水平对于鉴别甲状腺良恶组织具有重要参考意义。

分化性甲状腺肿瘤中脆性组氨酸三联体的表达及其临床意义

目的研究抑癌基因脆性组氨酸三联体(fragile histindine triad,FHIT)在分化性甲状腺肿瘤中的表达及其与病变的关系。方法分别应用免疫组化方法及原位杂交方法检测78例甲状腺肿瘤(腺癌38例,腺瘤40例)标本中FHIT蛋白及FHITmRNA表达。结果腺癌组和腺瘤组FHIT蛋白及FHITmRNA表达水平间差别有统计学意义(P<0.05)。FHIT蛋白与FHITmRNA表达水平呈正相关(r=0.715,P=0.000)。肿瘤有无转移及预后指数不同的甲状腺癌患者,FHIT蛋白和FHITmRNA表达水平间差别有统计学意义(P<0.05)。结论检测FHIT蛋白及FHIT mRNA水平对于鉴别分化性甲状腺肿瘤良恶性具有重要参考意义,其表达水平可能是判断甲状腺癌预后的观测指标。

甲状旁腺素相关肽对INS-1细胞株胰岛素分泌的影响

目的探讨甲状旁腺素相关肽(PTHrP)对大鼠胰岛β细胞瘤株INS-1胰岛素含量的影响。方法根据不同干预条件分为空白对照组、PTHrP干预组(分别应用1、10、100 pmol/L的PTHrP干预),48 h后应用放射免疫法检测各组葡萄糖刺激胰岛素分泌作用,Fura-3/AM荧光负荷技术测定Ca2+。Western Blot检测细胞胰岛素及胰腺-十二指肠同源框1(PDX-1)的表达。结果 PTHrP对INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力及Ca2+负荷呈浓度依赖性关系。PTHrP组上调胰岛素及PDX-1表达,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PTHrP可以促进胰岛β细胞胰岛素分泌及合成。

间歇性高糖对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52EA转分化的影响

目的:探讨间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52EA转分化干预作用。方法:NRK-52E细胞分为空白组、正常葡萄糖组、高糖组、间歇性高糖组,分别作用72 h后,Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶-2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达;CM2H2DCFDA试剂盒检测活性氧(ROS)含量。结果:高糖组及间歇性高糖组NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达均上调;间歇性高糖组TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达水平较高糖组高(P均<0.05),其ROS含量也显著高于高糖组(P<0.01)。结论:间歇性高糖能通过氧化应激诱导肾小管导管上皮细胞表达TGF-β1、MMP2,并促进NRK-52EA细胞转分化为α-SMA细胞。

高糖状态下甲状旁腺素受体1对乳腺癌的作用机制研究

目的阐明高糖状态下甲状旁腺受体1(PTH1R)对乳腺癌细胞株SHZ-88的作用机制。方法应用实时(real time)PCR分别检测0(对照组)、5、15、25mmol/L葡萄糖浓度下PTH1R mRNA水平;构建出PTH1R基因沉默(siPTH1R)的细胞模型后,分别应用MTT法、TUNEL-FITC/Hoechst33258及Western blot法检测对照组、25mmol/L葡萄糖处理组(高糖组)、25mmol/L葡萄糖处理的阴性PTH1R基因序列组(高糖siPTH1R-NC组)及高糖阳性PTH1R基因序列组(高糖siPTH1R组)细胞活力、细胞凋亡情况及Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果随着葡萄糖浓度升高,PTH1R mRNA水平增高,其中25mmol/L葡萄糖处理后PTH1RmRNA水平最高(均P<0.01);高糖siPTH1R组细胞活力(P<0.05,P<0.01及P<0.01)及Bcl-2表达(均P<0.01)低于对照组、高糖组及高糖siPTH1R-NC组;高糖siPTH1R组中细胞凋亡水平及Bax表达高于对照组、高糖组及高糖siPTH1R-NC组(均P<0.01);与对照组比较,高糖组细胞活力(P<0.01)及Bcl-2表达(P<0.01)增高,而Bax表达(P<0.01)降低。结论高糖状态下PTH1R表达水平与SHZ-88细胞增殖能力有关,抑制PTH1R表达可能为糖尿病合并乳腺癌治疗有效靶点之一。

甲状腺乳头状癌组织PTTG及PTTG mRNA表达研究

目的:检测PTTG在甲状腺乳头状癌组织中的表达,探讨其与甲状腺乳头状癌的关系。方法:在52例甲状腺乳头状癌组织及其癌旁组织中分别应用原位细胞凋亡检测(TuNEL)试剂盒测定原位细胞凋亡指数(apoptosis index,AI),应用免疫组化方法检测PTTG,应用原位杂交方法检测PTTG mRNA表达。结果:PTTG及PTTG mRNA在甲状腺乳头状癌组织中表达比相应癌旁组织显著升高(P=0.0091,P=0.0012):PTTG及PTTG mRNA灰度值与AI正相关(r=0.447,P=0.003;r=0.564,P=0.000)。结论:PTTG及PTTG mRNA表达升高可能参与甲状腺乳头状癌的发生发展,检测PTTG及PTTG mRNA对于甲状腺乳头状癌与良性组织鉴别诊断具有临床参考意义。