健康献血者血浆可溶性糖蛋白A(GPA)在抗-M与抗-“Mia”抗体阳性及阴性中表达差异的分析研究

目的分析健康献血者血浆中可溶性糖蛋白A(glycoprotein A,GPA)表达量与抗-M及抗-“Mia”抗体的相关性。方法收集2022年2月9日~2023年2月15日的健康献血者血浆:不规则抗体阴性的NN型(Ⅰ组,n=118)与MM型(Ⅱ组,n=51),抗-M抗体阳性的NN型(Ⅲ组,n=145)与抗-“Mia”抗体阳性的随机型(Ⅳ组,n=87),分别检测4组人不同个体血浆中GPA的含量,t检验分析GPA表达量的差异。结果Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组血浆中GPA平均含量分别为:9.941±0.252,10.97±0.256,5.139±0.129和4.28±0.139ng/ml。Ⅰ组与Ⅱ组的GPA平均含量较高,Ⅲ组与Ⅳ组的GPA平均含量较低,显示GPA平均含量在不规则抗体阴性(Ⅰ组与Ⅱ组)的血浆中较高,在抗-M与抗-“Mia”抗体阳性(Ⅲ与Ⅳ组)的血浆中较低,差异具有统计学意义(均P<0.01)。结论含有抗-M与抗-“Mia”抗体的健康献血者血浆中GPA含量明显低于抗体阴性的群体。该研究结果为深入探讨血浆中GPA是否有中和抗-M与抗-“Mia”抗体的能力,提高疾病诊断与安全输血打下基础。

临床患者血浆中β-内酰胺类药物&抗体致输血无效及对供者红细胞亲和力的研究

目的分析临床患者血浆中β-内酰胺类药物&抗体对供者红细胞的亲和力,探究药源性溶血性贫血及输血无效的临床特点。方法选择2021年11月~2022年4月期间临床送检的4例有β-内酰胺类药物用药史的临床患者,检测ABO与Rh血型,直接抗球蛋白试验(direct antiglobulin test,DAT)、不规则抗体鉴定(identification of irregular antibodies,IAT)与β-内酰胺类药物抗体及效价,对DAT阳性的患者红细胞进行酸放散并检测放散液中β-内酰胺类药物抗体。选择ABO和Rh同型的供者红细胞与患者血浆在37℃无菌条件下体外致敏,监测β-内酰胺类药物&抗体在0,24,48和72 h与供者红细胞的亲和力,并观察加入补体后的溶血程度。结果4例患者血浆中均存在β-内酰胺类药物抗体,停药前输血无效,停药后输血效果良好。患者1:A型,RhCCDee,DAT阳性(3+W),IAT阴性,血浆中存在头孢哌酮药物抗体(效价:1∶64)、阿莫西林药物抗体(效价:1∶16),放散液中存在头孢哌酮药物抗体。患者2:A型,RhCcDee,DAT阳性(4+W),IAT阴性,血浆中存在头孢哌酮药物抗体(效价:1∶128),放散液中存在头孢哌酮药物抗体。患者3:A型,RhCcDee,DAT阳性(4+),IAT阳性,鉴定为抗E抗体,血浆中存在阿莫西林药物抗体(效价:1∶16)、亚胺培南药物抗体(效价:1∶64)、头孢哌酮药物抗体(效价:1∶128),放散液中存在亚胺培南、头孢哌酮药物抗体。患者4:A型,RhCCDee,DAT阳性(1+),IAT阳性,鉴定为抗-E.c抗体,血浆中存在阿莫西林药物抗体(效价:1∶32),放散液中未检测到药物抗体。4例患者血浆与供者红细胞体外致敏24 h后DAT均为阳性,48和72 h内逐渐增强,加入补体后均可引起红细胞溶解。结论头孢哌酮、阿莫西林和亚胺培南三种β-内酰胺类药物&抗体可迅速结合到供者红细胞表面并随时间延长而增强,有补体存在的条件下可在24~72 h内破坏供者红细胞引起溶血,导致输血无效。

MNS血型相关基因GYPA、GYPB、GYPE mRNA全长序列多态性分析

目的:分析MNS血型相关基因GYPA、GYPB、GYPE mRNA全长序列的特征,了解MNS血型基因的多态性。方法:随机选取无偿献血者500人份离体24 h内的抗凝血各8 ml,以血型血清学方法鉴定MN、Ss、Mia血型。从500例样本中随机选取MNS与Mia血型不同组合的5例样本,使用密度梯度离心法分离外周血中的单个核细胞(PBMC)并提取总mRNA,使用逆转录试剂盒制备cDNA,采用巢式PCR(nested PCR)方法扩增目标片段,切胶回收后分别对GYPA、GYPB、GYPE mRNA全长序列进行测序,通过Oligo 6.0软件分析碱基序列。结果:血清学检测得到MN、Ss和Mia表现型,不同个体间的红细胞与抗-Mia血清反应存在凝集强度差异。检测了5例不同表现型组合样本的GYPA、GYPB、GYPE基因mRNA全长序列,1例样本的GYPA mRNA中exon-6完整缺失,其他4例样本的GYPA mRNA全长完整;2例样本的GYPB mRNA中exon-2完整缺失,Mia血型阴性;2例样本的GYPB mRNA全长完整,Mia血型阳性;1例样本的GYPB mRNA中exon-5存在碱基替换;5例样本的GYPE mRNA全长完整。结论:MNS血型相关基因具有明显的多态性,mRNA全长序列的检测为GYPA、GYPB、GYPE基因结构的分析与MNS血型抗原表达的深入研究奠定了基础。

中国人群MN血型中M、N等位基因多态性的研究

目的：检测血型糖蛋白GPA相关基因GYPA中全部外显子与部分内含子碱基序列,探讨中国人群MN血型中M、N等位基因的多态性.方法：随机选取国籍为中国人的无偿献血者225人份的血液样本,以血型血清学方法鉴定M、N血型表现型;自行设计引物,直接测序相关样本GYPA基因的exon-1～7全长碱基序列以及intron-1～7中部分碱基序列,根据序列中碱基的变异分析M、N基因的多态性.结果：M、N血型的基因定型与血清学检测结果一致;根据intron-1中-9位,exon-2中1、22、34、35、56位,intron-2中23位,intron-3中55位,intron-4中63位,intron-5中1373、1374、1375位,intron-6中55、189、190位和exon-7中712位等的变异,可以把M、N基因细分为M101、M102、M103、M201、M202、N101、N102、N103、N104、N201;同时,本研究发现在GYPA基因的intron-2中42、54位突变与59、60位间插入碱基T的变异;intron-3中-28、-29、-65、-102位等基因位点存在新的变异.结论：MN血型中M、N基因具有多态性,中国人群GPA相关基因GYPA的各外显子、部分内含子的结构特点揭示了中国人群的M、N血型基因的多态性,为临床输血、人类群体遗传学及分子生物学的研究提供相关的基础.

B亚型中Bx新等位基因的鉴定

目的对ABO血型中B亚型分子遗传背景的研究,发现并鉴定ABO新等位基因。方法对5份血型血清学鉴定为B亚型的样本,采用PCR-SSP、ABO基因第6及第7外显子直接测序方法进行基因定型;并对目的B亚型样本进行RT-PCR、巢式PCR扩增、测序,分析其cDNA结构的差异。结果5份血清学为B亚型的样本中,血清学鉴定为Bx的个体发现了一个新的B等位基因。该等位基因与B101等位基因相比,差异仅在于第7外显子的B基因序列中nt721位C>T突变。其余4份B亚型样本的ABO基因第6、7外显子都未发现新的点突变。结论首次在中国汉族人中发现一个721C>T新变异的B等位基因,该等位基因nt721位由C转变为T,241位氨基酸由精氨酸转变为色氨酸,可导致糖基转移酶活性的降低,表明ABO基因的第241位氨基酸对决定糖基转移酶活性是至关重要的。

MN血型GYPA基因测序方法的建立及应用于汉族人群检测

目的建立适合检测中国汉族人群MN血型GYPA基因的测序技术,用于中国汉族人群MN血型基因的分子遗传背景及遗传多态性的研究。方法根据GenBank的NG-007470基因参照序列,自行设计GYPA基因第1—7外显子共7对引物,以随机选取的55份中国汉族人群标本的DNA为检材,探索最佳反应体系与PCR扩增条件,同时扩增GYPA的第1—7外显子,含括了GYPA基因的全长外显子序列。使用PrismTM ABI3730XL DNA测序仪进行碱基序列分析,以Oligo分析软件分析碱基序列。检测结果的可靠性通过血型血清学、PCR-SSP基因分型方法进行验证。结果应用该方法可以在同一扩增条件下同时扩增GYPA基因的全部外显子,同步检测到GYPA基因共7个外显子的碱基序列,55份标本的基因测序结果与血清学、PCR-SSP基因分型结果完全一致。结论本研究的GYPA基因测序方法准确、可靠,适用于中国汉族人群的GYPA基因测序。

深圳地区妊娠期孕妇血清IgG抗体效价与产后HDN的相关性

目的探讨深圳地区1069例妊娠期孕妇血清中红细胞血型IgG类抗体特异性、效价对母婴血型不合引起的新生儿溶血病(HDN)的影响,为新生儿免疫溶血性疾病的早期诊断及预防提供依据。方法对深圳地区的1069例与丈夫红细胞血型不合的孕妇血清进行IgG类抗体筛选,对不规则抗体阳性者鉴定抗体的特异性,采用以间接抗球蛋白法定期检测相应抗体的效价。并随访高胆红素血症的新生儿,对其进行红细胞直接抗球蛋白试验、血清游离试验和红细胞放散试验等,以了解黄疸患儿中因红细胞血型IgG抗体引发HDN的构成。结果1069例样本中,IgG抗A/B效价≥64者765例,产生HDN的457例;IgG抗A/B效价<64者236例,产生HDN的61例。ABO-HDN占总调查人数45.65%。IgG抗D、C、D+C、M、Mur≥16者57例,产生HDN的54例;IgG抗D、C、D+C、M、Mur<16者11例,产生HDN的1例。非ABO-HDN占总调查人数5.14%。结论深圳地区的孕妇血清中IgG类抗体效价与新生儿溶血病密切相关,HDN发病率有明显偏高的现象。定期筛选与鉴定孕妇体内IgG类抗体可预测新生儿溶血病的发生、评估HDN的严重程度及提高HDN的治愈率。

RhD mRNA剪接体全长外显子序列扩增技术的应用

目的探讨建立的RhD mRNA剪接体多态性检测技术的有效性与实用性。方法采用设计的两对引物扩增全长RhD mRNA外显子,完全避开RHCE基因的干扰,特异性扩增并分析了随机选取的非血缘关系50例标本的RhDmRNA剪接情况。结果两对引物能扩增RhD mRNA剪接体的全长外显子基因并分析出RHD基因剪接体的多态性,扩增出4种剪接体的特异性:exon-1-3扩增产物:415 bp;exon-3-10扩增产物均由3种不同组合构成:产物一:约880 bp,产物二:约750 bp;产物三:约550 bp。50例标本:exon-1-3扩增产物:全部无缺失;exon-3-10扩增产物:带1无缺失,带2缺exon-7的占总标本27例、缺exon-7,8的占总标本6例、缺exon-8,9的占总标本12例、缺exon-7,9的占总标本5例,带3全部缺exon-7,8,9。结论建立的RhD mRNA剪接体多态性检测技术可以准确扩增RhD mRNA全长基因,并有效分析该基因剪接体的多态性。

中国汉族人群MN血型相关基因gypa分子多态性的研究

本研究探讨中国汉族人群MN血型相关基因gypa的多态性。随机选取中国汉族人群中无血缘关系的无偿献血者202人份,以血清学方法鉴定样本的MN血型表现型。根据GenBank的NG-007470基因参照序列设计gypa第2外显子引物,对202人份的DNA进行PCR扩增,同时对扩增产物进行直接测序。结果表明:所有样本的gypa第2外显子第1、56位碱基均发生了变异,其中MN表现型杂合子主要以1A>C、22T/C、34A/G、35T/G、56T>C的形式存在;MM表现型纯合子主要以1A>C、22C、34G、35T、56T>C的形式存在;NN表现型纯合子主要以1A>C、22T、34A、35G、56T>C的形式存在。结论:中国汉族人群MN血型相关基因的多态性主要由gypa第2外显子的第1、22、34、35、56共5个位点的多态性所决定,其中第1、56位为非功能性SNP位点。

糖基转移酶活性测定方法的建立及应用

目的:建立糖基转移酶的测定方法,探讨人类血清中A、B糖基转移酶的活性,为检测酶的含量与研究酶的活性打下基础。方法:用测定糖基转移酶活性的试剂盒(glycosyltransferase activity kit)绘制适合本实验室的磷酸盐标准曲线。以该标准曲线为基础,测定已知A型、B型人血清中A、B糖基转移酶的活性。结果:绘制出适合本实验室应用的糖基转移酶测定的标准曲线:y=2671,3x-0.596,R^2=0.9998;同时建立起测定人类血清中A、B糖基转移酶的方法。结论:建立的糖基转移酶活性的测定方法适用于通用型糖基转移酶活性的测定,同样适用于人类血清中A、B糖基转移酶活性的检测。

中国人群部分GPA分子结构的改变对MN血型抗原表达影响的研究

目的通过对GPA相关基因GYPA部分intrion-1、intrion-2及exon-2区域的研究,探讨中国人群部分GPA肽链中氨基酸的改变与MN血型抗原表达的相关性。方法在无血源关系的部分中国无偿献血者人群中鉴定MN血型,以血清学方法分别与抗-M、抗-N反应,随机选择凝集强度上无明显差异的150例样本提取DNA,应用自主设计的一对特异性引物直接检测以上样本的exon-2及部分intron-1、intron-2的碱基序列,分析GPA分子中氨基酸的改变与M、N血型抗原特异性表达之间的关系。结果通过基因测序,发现了GPA肽链中4个座位的氨基酸发生了改变,此改变未对MN血型抗原表达造成影响,但可以把M、N血型基因细分为:MGMTMGMG,MTMT,N1N1、N1N2、N2NV,MGN1,MGN2、MGNV、MTN1、MTN2、MTNV基因型。结论 GPA肽链中部分分子结构的改变,并未影响MN血型抗原的表达,这一发现可以帮助研究中国人群GPA分子特征与MN血型抗原表达间的关系,并为追踪中国人群血型糖蛋白家系的分子生物学多态性奠定基础。

RhD mRNA剪接体实时荧光定量方法的建立

目的建立RhD mRNA剪接体实时荧光定量技术,了解不同个体中RhD mRNA剪接体的含量与表达水平。方法制备本实验室SYBR Green荧光染料定量检测RhD mRNA剪接体的标准曲线,设计RhD mRNA剪接体的引物,提取随机选择的150例血液样品中的mRNA,反转录为c DNA,并以c DNA为模板进行PCR扩增,扩增时加入荧光基团,利用荧光信号实时监控整个PCR进程,最后通过标准曲线来计算RhD mRNA各剪接体的表达量。结果根据荧光定量的峰值读数,以2nd Derivative Max计算方法,计算出所测样本的理论值、实测值,两个重复孔的平均值作为所检测样本RhD mRNA剪接体的表达量。结论此方法可以准确定量不同个体RhD mRNA剪接体的拷贝数,为RHD血型基因的研究与抗原表达的研究提供依据。

类孟买型在两个近亲与随机婚配家系中的遗传特点

目的调查分析近亲与随机婚配的两个家系成员个体间的类孟买型分布状态，了解类孟买表现型在该两家系中的遗传特点。方法以血型血清学试验作为检测基础，用PCR—SSP法进行ABO基因分型，扩增FUT1，FUT2基因，对PCR扩增产物进行直接测序或分子克隆测序后，分别鉴定两家系成员的类孟买表现型。结果近亲婚配的家系1中，先证者与其兄、弟均从父母中得到了FUT1基因的547548住两碱基AG缺失（h1），880-881住两个T碱基缺失的突变点（h2），表现为h1，h2类孟买型；父亲为^2基因携带者；母亲与先证者的女儿均为^1基因携带者。随机婚配的家系2中先证者与兄弟姐妹共4人，只有先证者本人的两条单倍体均遗传了父、母亲的FUT1基因的547-548位两碱基AG缺失（hi），表现为h1h1类孟买型；其他兄弟姐妹与父亲、母亲、先证者的儿子均为h1基因携带者，血型为正常的表现型。两家系成员的FUT2住点均为正常的野生型。近亲婚配家系Ⅰ中hh纯合子遗传发生率为100％；随机婚配家系Ⅱ中M纯合子遗传发生率为25％。结论该两个家系调查发现，类孟买表现型的遗传方式符合常染色体隐性遗传规律，近亲婚配比随机婚配可大大增加类孟买表现型的遗传概率。

中国人群MNS血型低频抗原Vr,Mta,Ria,Cla,Nya,Or,Osa,SD和Mit基因座多态性调查研究

目的 调查中国人群MNS血型低频抗原Vr,Mta,Rr,CP,Nva,Or,Osa,SD和Mit基因座碱基变异点,为MNS血型低频抗原的研究、临床输血与免疫血液病的诊断与治疗打下基础.方法 随机选取深圳市血液中心无偿献血人群500人份提取血样DNA,应用自主设计的引物直接测序分析GYPA的A3,GYPB的B4碱基序列,分析中国人群MNS血型低频抗原Vr,Mta,Rr,CP,Nya,Or,Osa,SD和Mit基因座的突变位置.结果 从GYPA的A3,GYPB的B4中分析了MNS血型低频抗原Vr,Mta,Rr,CP,Nya,Or,Osa,SD和Mit基因突变位点,鉴定了相关抗原基因的变异点分别为：GYPA的A3中197,230,226,138,148和217;GYPB的B4中173和161.结论 MNS血型抗原Vr,Mta,Rr,CP,Nva,Or,Osa,SD和Mit虽为低频抗原,但在免疫条件下同样会引起输血反应与严重的新生儿溶血病（HDN）,使用基因检测的方法可以解决低频抗体血清的短缺,为临床输血与免疫性疾病诊断以及人类群体遗传学研究打下基础.

流式细胞术在血小板相容性试验中的应用价值

目的探讨流式细胞术(FCM)在临床血小板相容性试验中的应用价值。方法应用FCM与固相凝集法同时对102名血小板输注无效的临床患者进行血小板供受者间的相容性试验,分别选择了固相凝集法交叉配血阴性或FCM中mean值最小的供者血小板应用于临床患者,追踪输注效果。结果 65名血浆中存在未知特异性抗体的患者,经FCM选择的供者输注血小板后,患者的CCI上升指数为85%,固相凝集法选择的供者输注后CCI的上升指数为23%。结论 FCM较固相凝集法在血小板相容性试验中具有更灵敏、更简单、更快捷、更准确的优点,应用FCM进行血小板相容性试验对提高临床的输注疗效具有重大的意义。

贵州地区布依族人群MNS血型基因GYPA和GYPB的群体遗传学研究

目的研究贵州布依族人群MNS血型基因GYPA和GYPB的遗传多态性。方法对随机抽取的138例贵州布依族献血者血样进行MNS血型血清学分型，并通过已建立的基因测序体系对GYPA的第二外显子和GYPB的第三外显子（B4）进行测序。结果贵州布依族人群的M，N，S和S抗原的基因频率分别为53．26％，46．74％，2．54％和97．46％，同时获得了M，N，S和s相关基因GYPA和GYPB的碱基序列。该研究获得了贵州布依族MNS血型的遗传特点，并与中国汉族人群无明显差异。结论该研究填补了贵州少数民族布依族MNS血型的血清学与分子生物学数据的空白，提示贵州少数民族和汉族人群间具有较为明显的民族融合特点，此研究还为临床输血、器官移植以及人类的遗传关系和种族迁移的研究打下了基础。

异基因外周血造血干细胞移植后血型基因型与抗原的转变

目的 探讨异基因外周血造血干细胞移植 ( Allo-PBSCT)后患者 ABO、Rh血型的转变在血液病移植治疗中的意义。方法 选择 2例非血源关系的供、受者作为研究对象 ,采用基因分型与血清学方法检测移植前后 ABO、Rh血型的表达 ,追踪移植后患者血型基因型与抗原的转变。结果 2例患者分别在移植后第 7天与第 1 0天检测到供者的 A、Rh( c)基因 ,第 7天与第 1 5天不同程度地表达供者的 ABO、Rh血型抗原。结论 观察 ABO与 Rh血型的转变可作为植入证明的检测方法之一 ,且直观、迅速。

GYP mRNA基因可变剪接对MNS血型糖蛋白GPA和GPB在细胞表面定位的影响

目的分析MNS血型相关基因GYPA、GYPB mRNA剪接体多态性,探讨各种剪接体编码的GPA和GPB蛋白异构体的亚细胞定位与MNS血型抗原表达的相关机理。方法随机选取无偿献血者10份血液,提取外周血总mRNA,反转录为cDNA后,以巢式PCR方法扩增GYPA、GYPB基因的开放阅读框并进行Sanger测序,碱基序列与GYPA(NCBI:NM_002099)、GYPB(NCBI:NM_002100.5)比对。得到的GYPA、GYPB开放阅读框的野生型及各种剪接异构体编码序列后,通过融合PCR技术分别与绿色荧光蛋白(GFP)编码基因融合并克隆后转染到HEK293细胞进行过表达,通过聚焦激光扫描显微镜监测GPA-GFP和GPB-GFP融合荧光蛋白的亚细胞定位。结果2例标本的GYPA mRNA中缺失外显子1与外显子2,预测的GPA蛋白异构体缺失2~26位氨基酸,GYPB mRNA全长序列完整。6例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA中缺失外显子2,预测的GPB蛋白异构体缺失13~45位氨基酸,其他外显子序列完整。1例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA的外显子5中364~385位碱基被AG替换,显示氨基酸信号肽截短。其他标本的GYP mRNA全长序列完整。GP-GFP融合蛋白的荧光信号的观察结果表明,根据各RNA剪接体克隆表达的GPA、GPB糖蛋白异构体均可表现出细胞膜表面定位分布,其中的一些可变剪接导致蛋白异构体发生不同程度的细胞内弥散,影响蛋白在细胞表面分布的速度和比例,可能构成MNS抗原强弱的原因之一。结论GYP mRNA剪接体有明显多态性特征,但GYP mRNA的部分片段缺失不影响其编码的蛋白异构体在细胞表面的定位分布,能够确保其展示MNS抗原特性。

RHD mRNA剪接体与RhD抗原表达的相关性及其在输血及妊娠中的免疫应答研究

目的通过探讨RHD mRNA剪接体多态性与RhD抗原表达的强度在临床输血、妊娠中的异常免疫应答,为RhD血型定型标准与输血原则提供理论依据。方法选择案例1:RhD阳性(血清学凝集强度达4+)的男性患者因为多次输RhD阳性血合并自身免疫性疾病,血浆中产生了抗-D。案例2:RhD弱阳性孕妇怀孕RhD阳性胎儿产生了抗-D。案例3:Rhccdee表型的地贫患儿因长期(8年)输注常规定型为RhD阴性的血液后产生了抗-D。以上3例样本提取全血的mRNA通过反转录成cDNA,使用RT-PCR法通过自主设计的引物进行扩增测序与分析RHD mRNA剪接体的多态性结构。结果所选的3例患者中患者1、患者2均以3种剪接体的多态性表达了RHD基因。患者1的RHD mRNA剪接体形式:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,并且在exon-3的第426位发生C>A突变、exon-5的707位发生A>G突变、713位发生T>C突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;患者2的RHD mRNA剪接体:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-8,9,未发现其他核苷酸突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;因为患者3是RhD阴性,缺失RHD基因全部外显子,因此未检测到RHD mRNA剪接体的多态性。结论 RhD抗原的表达直接受RH基因调控,RhD mRNA剪接体的多态性决定RhD抗原强度的差异。RhD抗原弱阳性或阴性的受血者在接受RhD阳性血液时也受同种异体免疫产生抗-D的风险。