生物体液中美多洛尔和α-羟基美多洛尔反相离子对HPLC测定

建立了同时测定人血浆、唾液和尿液中美多洛尔及其代谢物α-羟基美多洛尔的反相离子对高效液相色谱-紫外检测法。本法回收率≥92%,色谱分离效果好,而层析时间<10min,并有较高的特异性、重复性及精密度,日间及日内测定的变异系数≤6.3%。美多洛尔和α-羟基美多洛尔在上述体液中的最低检测限,除血浆中α-羟基美多洛尔为50ng/ml外,余均为10ng/ml。无论用外标法还是以普萘洛尔为内标物的内标法定量,在0.1-10μg/ml范围内。

奎尼丁试管内对人和大鼠肝微粒体安替比林代谢的影响

用HPLC方法研究奎尼丁试管内对人和Wistar大鼠肝微粒体安替比林(AP)的3甲基-羟化酶、4-羟化酶和2-脱甲基酶活性的影响。当奎尼丁浓度≥0.02mmol/L,≥0.10mmol/L和≥0.50mmol/L时,可分别显著抑制人肝微粒体AP4-羟化酶、3甲基-羟化酶和2-脱甲基酶的活性;对大鼠肝微粒体,奎尼丁≥0.02mmol/L时,能显著抑制AP的3甲基-羟化酶和4-羟化酶活性,而≥0.10mmol/L时也可抑制2-脱甲基酶活性。奎尼丁对AP的3甲基-羟化酶、4-羟化酶和2-脱甲基酶活性的IC_(50)在人肝微粒体分别为:0.550,0.107和0.450mmol/L;而在大鼠的肝微粒体则分别为:0.340,0.080和0.500mmol/L。

小剂量奎尼丁对安替比林消除的影响

用高效液相法测定了小剂量(5mg)奎尼丁对6名健康受试者唾液中安替比林的药动学参数、尿中安替比林及其代谢物3-羟甲基安替比林、4-羟基安替比林和去甲基安替比林排泄率的影响。结果表明,小剂量奎尼丁对唾液中安替比林的半衰期、消除速率常数、清除率、药一时曲线下面积和表观分布容积等药动学参数均无影响,对尿中安替比林、3-羟甲基安替比林、去甲基安替比林及总代谢物排泄量亦无明显影响,但能减少尿中4-羟基安替比林的排泄量(P<0.05)

申报国家重点学科工作的体会

笔者根据评选国家重点学科的主要目的、指导思想以及评选内容、标准,与重庆医科大学医学检验系的现状比较,突出其学科的特点与亮点,强调其学科的性质、发展势头和对医学的影响,通过申报国家重点学科的工作,是对已有的工作进行总结评估,从而发现差距和不足,明确努力的方向,促进学科建设,形成今后发展的思路。

检验医学本科课程体系建设的实践与探讨

检验医学是现代实验室技术与生物医学渗透结合，在近二十年内形成和发展迅速的一门多学科交叉的边缘学科。近年来、随着生物化学、免疫学、遗传学、细胞生物学和分子生物学的重大进展，临床医学对该学科的依赖和需求日益加强，其重要性越来越受到重视。但长期以来，我国的临床检验工作仅是介于基础和临床医学间的辅助性技术专业、由于历史原因，现有医学检验专业队伍中大部分为中专毕业生．除少数的大专、本科生外，

生物体液中美多洛尔和α-羟基美多尔反相HPLC测定法

建立了以苯基柱为固定相同时测定人血浆、尿液或唾液等生物体液中美多洛尔(M)和α-羟基美多洛尔(α-OHM)的反相离子对HPLC方法,流动相由90％甲醇、10％2.5 mmol/L庚烷磺酸钠水溶液、0.05％乙酸组成,225nm紫外光波检测,以普萘洛尔为内标物,M、α-OHM及内标物均可获峰型尖锐对称之基线分离。在0.5～10μg/ml范围内,M和α-OHM的回收率均≥92％,CV均【

RNA干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究

背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。目前,利用RNAi已抑制了包括cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个内源基因的表达。同时在艾滋病、病毒性肝炎等的治疗研究中也已取得一定进展。但对肝癌等恶性肿瘤中高表达的hTERT基因,国内外还未见相关研究报道。本研究利用RNAi技术,在体内外抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌治疗的可行性。方法:设计干扰hTERT基因的小片段RNA,构建重组表达质粒pTZU6+1-shRNA-hTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi,采用流式细胞检测技术、RT-PCR法、免疫组化等同时检测RNAi治疗组和对照组hTERT基因表达及细胞增殖变化。结果:体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6+1-shRNA-hTERT导入肝癌SMMC7721细胞株3～7天后,肝癌细胞生长抑制率达37.5%;细胞周期相分布发生显著变化,S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加;hTERT的mRNA表达由99.4%下调到53.1%,hTERT蛋白表达由86.3%下调到46.6%。裸鼠体内实验结果显示,质粒pTZU6+1-shRNA-hTERT注射裸鼠皮下移植瘤7天后,瘤体积明显缩小,hTERT的mRNA表达由99.1%下调到76.2%,hTERT蛋白表达由87.2%

家蝇抗菌肽抗菌活性及抗菌机制的初步研究

目的 研究家蝇抗菌肽的抗菌活性及抗菌机制。方法 用损伤感染的方法诱导家蝇幼虫表达抗菌肽 ,通过 Sephadex过滤层析和 HL PC技术纯化提取 ,用平板法和稀释法作抗菌活性试验 ,并用电子扫描技术研究抗菌肽的抗菌机制。结果 家蝇抗菌肽对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA)均有明显的抗菌活性。大肠埃希氏菌与 5 0 μg/ml的纯化抗菌肽溶液一起 37℃孵育 6 0 min后 ,大肠埃希氏菌不能存活。经电镜扫描观察发现 ,细菌的细胞膜出现破损和穿孔现象。结论 家蝇抗菌肽具有明显的广谱抗菌活性 ,对阴性杆菌和阳性球菌均有杀伤作用。

联合检测MPO、IL-6和hs-CRP对冠心病危险分层的价值

目的探讨联合检测3种血清炎性标志物对冠心病危险分层的价值。方法对381例住院冠心病患者[急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)105例,不稳定性心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)162例,稳定性心绞痛(stable angina pectoris,SAP)114例]和337例对照组[非冠心病患者(non-coronary heart disease,NCHD)187例和健康体检者150例],分别用选择抑制法检测血清髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、微粒子化学发光免疫法检测白细胞介素-6(IL-6)、免疫荧光分析法检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)。结果急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)组MPO、IL-6、hs-CRP均显著高于SAP、NCHD和健康组(P=0.000)。MPO以AMI组最高,UAP组其次,SAP组再次,均明显高于NCHD和健康组(P<0.05)。UAP组与SAP组IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05),但明显低于AMI组,高于NCHD及健康组(P<0.05)。SAP、NCHD、健康体检者3组间hs-CRP无统计学差异,但显著低于UAP组及AMI组(P<0.05)。AMI患者MPO多轻度升高(89.52%)并伴IL-6和hs-CRP重度升高(分别达90.48%和96.19%),UAP患者MPO多轻度升高(80.86%)并伴IL-6和hs-CRP中度升高(分别为67.28%和78.40%)。SAP患者MPO和hs-CRP轻度升高率分别为48.25%和53.51%,IL-6中度升高率为54.39%。单项炎性标志物对ACS的诊断灵敏度均较高,但特异性均不理想。串联分析3种炎性标志物诊断ACS的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为74.53%、79.82%、89.64%、57.23%和76.12%。结论联合检测MPO、IL-6和hs-CRP可鉴别诊断冠心病不同病理阶段,提高诊断ACS的特异性和阳性预测值,有助于冠心病的危险分层。

苦参碱对K562细胞早期原癌基因表达的影响

背景与目的:苦参碱具有抗癌活性,我们前期的研究也证明苦参碱对K562细胞有增殖抑制与诱导分化作用。但苦参碱诱导K562细胞多向分化的分子机制尚不清楚。我们拟对其分子机制进行初步研究。方法:采用RT-PCR半定量技术分别检测0.2mg/ml苦参碱对K562细胞原癌基因c-myc、c-jun、H-ras、p21和肝细胞核转录因子HNF-1α表达的影响。结果:经苦参碱处理3h后K562细胞c-myc、c-jun、HNF-1αmRNA表达明显降低,而H-ras、p21mRNA表达明显增高。结论:0.2mg/ml苦参碱引起的K562细胞相关癌基因表达变化可能与K562细胞的增殖抑制和诱导分化有关。

苦参碱对内毒素致炎大鼠PLA_2活性影响及其抗炎机制研究

目的 研究苦参碱抗炎机制和其抑制磷脂酶 A2 (PL A2 )活性的作用。方法 用 [3H]花生四烯酸掺入大肠杆菌膜为底物检测细胞内外 PL A2 方法 ,测定了苦参碱对内毒素 (L PS)造成的大鼠急性内毒素炎症时血清中分泌型磷脂酶 A2 (s PL A2 )活性和外周血白细胞中胞浆型磷脂酶 A2 (c PL A2 )活性的影响 ,同时用 Fura2 - AM作荧光指示剂检测胞内游离 Ca2 + 浓度的变化 ,并通过大鼠足跖肿胀实验证实苦参碱的抗炎作用。结果 在 L PS介导的急性内毒素血症大鼠 ,30 mg/ m L 的苦参碱 0 .2 m L ip1h对外周血 s PL A2 抑制效果最好 ,抑制率达 (81.9± 1.8) % ,此时胞内 c PL A2 活性抑制率是 (2 8.4± 6 .0 ) % ,而 Ca2 +浓度是 (15 7.10± 2 0 .5 6 ) nmol/ L,比对照升高 15 .3%。足跖肿胀实验亦证明苦参碱对炎症有显著抑制作用。结论 苦参碱是一种具有抗炎作用的新型 PL A2

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备

目的构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗。方法采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体。结果成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28℃,5h,0.5mmol/LIPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体。结论成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法 ,并制备了其抗体。

家蝇幼虫抗菌肽对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌活性

通过超声处理诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,观察抗菌肽对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌作用。超声处理诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,经分离纯化后,体外试验分析抗菌肽的抑菌特性。结果表明,术后对照组小鼠相比其他两组活动减少,且3组白细胞计数均减少。14 d后对照组存活率为30%,明显少于磺胺米隆组90%(P<0.05)和抗菌肽组80%(P<0.05)。对照组小鼠的重量在第6 d开始下降,明显少于其他两组(P<0.05)。而无菌对照组无死亡,重量持续增加。因此,超声处理能诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,其对铜绿假单胞菌感染的ICR小鼠创面有较强抗感染作用,能明显增加其存活率。

苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基因的研究

目的研究苦参碱诱导人红白血病K562细胞分化的分子机制。方法应用改良的mRNA差异显示逆转技术(DDRT-PCR)筛选苦参碱诱导K562细胞分化相关的差异表达基因;对差异cDNA片段纯化、克隆、测序及Blast分析,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法验证。进一步对其中的未知差异cDNA片段采用North-ern杂交确定其转录本的大小及组织分布特性,进而充分利用多种生物信息学资源对差异片段进行结构和功能的预测。结果苦参碱诱导K562细胞前后存在明显的基因表达差异,筛选获得了17条差异条带。其中4个差异显著片段经RT-PCR验证后,在Genbank中分析,有3个为已知基因,1个可能为未知基因,暂命名为KH基因。Northern杂交证实KH基因转录本的大小为1.35kb,分布于正常人体脑组织中。结论苦参碱具有诱导K562细胞基因表达谱发生变化的作用,由苦参碱诱导的K562细胞分化是一个多基因参与的过程;KH基因可能是苦参碱作用K562细胞后表达量发生改变的未知基因,可能与细胞癌变有关。

血管内皮生长因子及其Flt-1受体在白血病细胞中的表达

目的 探讨人白血病细胞系血管内皮生长因子 (VEGF)及其Flt 1受体的表达 ,进一步阐明VEGF在白血病细胞异常增殖中的作用机制。方法 以人脐静脉血管内皮细胞系ECV3 0 4作为对照 ,采用RT PCR半定量技术和免疫组化检测体外培养的人白血病细胞系K5 62和HL 60中VEGF及Flt 1的表达。采用MTT试验观察VEGF反义寡核苷酸 (VEGF AS)对白血病细胞体外增殖的影响。结果 K5 62和HL 60细胞同时表达VEGF和Flt 1mRNA和蛋白。VEGF AS能够抑制白血病细胞体外增殖。结论 在白血病细胞异常增殖中自分泌VEGF可能起着重要作用。

家蝇抗菌肽的免疫诱导及抗菌活性研究

目的诱导家蝇产生抗菌活性肽,鉴定其抗菌活性。方法家蝇经针刺损伤感染大肠埃希菌,免疫诱导24h后制成组织匀浆,经低温盐析、超速离心、Sephadex G50层析、RP-HPLC等技术分离纯化抗菌肽。K-B法和稀释法测定抗菌活性。结果家蝇体内含有抗菌活性成分,家蝇经损伤免疫诱导后分泌抗菌肽的量明显增加,经分离纯化得到了一个色谱纯的抗菌活性肽。该抗菌肽对标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)均有抗菌活性,其MIC分别为2.4μmol/L、3.6μmol/L和4.8μmol/L。结论免疫诱导可促进家蝇抗菌肽的分泌,分泌的抗菌肽有广谱抗菌活性,对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑制作用。

轻微肝性脑病患者血清中代谢物组的研究

目的检测轻微肝性脑病(minimal hepatic encephalopathy,MHE)患者血清中的代谢物组,初步建立MHE诊断模型。方法采用核磁共振(NMR)方法检测25例肝硬化患者(肝硬化组)、25例轻微肝性脑病患者(MHE组)和30例健康对照(对照组)血清中的代谢物,应用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对NMR谱数据进行模式识别分析,并用临床标本验证代谢组模型诊断MHE的可行性。结果 OPLS-DA模型显示,健康对照与肝硬化患者(包括肝硬化组和MHE组患者)之间的区分非常明显,模型的质量参数R2X=35.1%,Q2Y=0.902;肝硬化组和MHE组标本可区分开来,模型质量参数R2 X=30.4%,Q2 Y=0.817。与对照组相比,肝硬化组和MHE组患者血清中葡萄糖、琥珀酸盐、柠檬酸盐等含量增高,低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、胆碱等含量减少;与肝硬化组相比,MHE组患者血清中的谷氨酰胺、苯丙氨酸、丙酮增高,缬氨酸和异亮氨酸降低。模型准确预测了10例MHE血清标本中的8例。结论基于1H NMR代谢组学技术可同时检测患者血清中多种代谢物质,有助于研究肝硬化和MHE的发病机制,可能为MHE的诊断提供一种新的手段。

抗菌肽PR39真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用

目的构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用。方法采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和免疫荧光法检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果成功构建了抗菌肽PR39的真核表达载体pIRES2-GFP/PR39,并能在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达抗菌肽PR39。表达抗菌肽PR39的巨噬细胞杀灭和清除胞内菌的能力明显增强。结论抗菌肽PR39基因能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达并发挥抗菌作用。

携人IL-12基因腺病毒的构建及其对Hep3B细胞增殖及TGF-β表达的影响

目的:构建携带人IL-12的重组腺病毒,观察其对Hep3B增殖及TGF-β表达的影响。方法:PCR扩增IL-12基因,构建穿梭质粒pAdTrack-IL-12;穿梭质粒经Pme I线性化后转化AdEasier Cell,E.coli BJ5183内同源重组;PacⅠ酶切重组腺病毒质粒,转染AD293,包装病毒;病毒pAd-IL-12感染肝癌细胞Hep3B,以RT-PCR、Western blot检测白介素12的表达;MTT法检测肝癌细胞的增殖情况;RT-PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)的表达。结果:成功构建携IL-12基因的重组质粒,并成功包装可高效感染Hep3B的腺病毒pAd-IL-12;RT-PCR以及Western blot结果表明,病毒pAd-IL-12感染Hep3B后可高表达白介素12,并且与对照组相比Hep3B增殖能力显著降低(P<0.05),TGF-β表达量也降低(P<0.05)。结论:可高表达IL-12的腺病毒包装成功,感染肝癌细胞Hep3B后抑制其增殖,同时也下调TGF-β的表达,为进一步研究IL-12的肿瘤治疗作用奠定了基础。